Vamos a demostrar dos protocolos hoy que demuestran cómo estudiar la función de la célula NK. Hay dos aspectos clave de la función celular NK que es capaz de erradicar las células tumorales y es capaz de migrar al microambiente tumoral. Estos dos protocolos demostraremos la capacidad de las células NK para erradicar las células tumorales y también es capaz de migrar al microambiente tumoral.
Así que los dos protocolos que vamos a demostrar hoy son sencillos, no requieren el uso de la actividad radioeléctlica y se pueden establecer en la mayoría de los laboratorios que tienen la capacidad de hacer trabajo de biología molecular y cultivo celular. Suresh Bugide y Suresh Chava, que son dos asociados postdoctorados en mi laboratorio, demostrarán estos dos protocolos hoy. Dos evalúan la citotoxicidad mediada por células NK usando LDH, primero crecen una línea celular de cáncer de hígado humano a 70-80% de confluencia en un plato Petri de cultivo celular de 100 milímetros a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.
El día del experimento, lave el cultivo con cinco mililitros de PBS antes de tratar las células con un mililitro de 0,25% de trippsina EDTA hasta que las células se hayan separado de la parte inferior de la placa. Cuando se haya obtenido una sola célula de suspensión añadir 10 mililitros de medio de cultivo celular a las células y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación. Lavar el pellet celular con cinco mililitros de PBS antes de volver a suspender las células a una vez 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo fresco.
A continuación, sembrar 100 microlitros de las células de cáncer de hígado humano objetivo por pozo en triplicado por condición de tratamiento en una placa de 96 pozos y añadir una por 10 a las 5a células NK humanas en 100 microlitros de medio a cada pozo de célula objetivo. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Al final de la incubación, peletiza las células por centrifugación y transfiere 100 microlitros de sobrenadantes de cada pozo a pozos individuales de una nueva placa de 96 pozos.
Agregue 50 microlitros de sustrato de LDH a cada pozo mezclando a fondo e incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, detener la reacción con 50 microlitros de solución de parada y medir inmediatamente la absorbancia en un lector de placas a 490 y 680 nanómetros. A continuación, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de citotoxicidad de células NK.
Evaluar la citotoxicidad mediada por células NK utilizando calceina AM después de cultivar células de línea celular de cáncer de hígado humano a una confluencia de 70-80%, como se demostró re-suspender las células en tres mililitros de DMEM libre de suero y etiquetar las células con 1,5 microlitros de 10 de la solución de calceina AM milimolar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y lavar las células dos veces con cinco mililitros de PBS por lavado. Re-suspender las células en un uno por 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo y añadir 100 microlitros de células a cada pozo de una placa de 96 pozos en triplicado por condición de tratamiento.
A continuación, en un tiempo 10 a la 5a células NK humanas en 100 microlitros de medio de cultivo a cada pozo de células diana y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas. Después del final de la incubación, capture al menos 10 campos diferentes de imágenes de las células positivas de calceina AM para cada réplica de cada condición de tratamiento en un microscopio de fluorescencia a un aumento de 10 veces. A continuación, calcule el porcentaje de citotoxicidad utilizando la fórmula.
Para medir la migración de células NK en respuesta a estímulos quimiotácticos, recoja células NK humanas de un cultivo de 70-80% confluente y vuelva a suspender las células a una concentración media de cultivo celular NK 2,5 veces 10 a 6 por mililitro de concentración media de cultivo celular NK libre de suero. A continuación, agregue 600 microlitros de medio libre de suero que contenga el atractor de quimio de células NK de interés por pozo y coloque un inserto de cultivo de 6,5 milímetros de diámetro con cinco poros micrómetros en cada pozo de medio. Luego agregue 100 microlitros de células NK al compartimiento superior de cada plaquita y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas.
Al final de la incubación transfiera todo el volumen de células migradas no adherentes desde la parte inferior de cada pozo a tubos FACS individuales de cinco mililitros y agregue 50 microlitros de un número predeterminado de cuentas de recuento de citometría de flujo a cada tubo. A continuación, utilizando un citometro de flujo evalúe cada muestra de celda de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar y calcule el número absoluto de células NK migradas utilizando la fórmula. El knockdown ATF4 reduce significativamente la citotoxicidad mediada por células NK en comparación con las células NK que expresan ARN de horquilla corta no específico.
Después de la tinción con calceína AM el número de células de cáncer de hígado humano viables disminuye después del co-cultivo con células NK humanas en comparación con las células de cáncer de hígado humano cultivadas sin células NK. Como era de esperar, el knockdown DE ATF4 a través de ARN de horquilla corto reduce la matanza mediada por células NK de células cancerosas del hígado humano como lo demuestra un mayor número de células de calceína AM positivas en estos cultivos. Además, se observa una cantidad significativamente mayor de migración de células NK en respuesta al medio que contiene quimiocina en comparación con las células NK expuestas al medio de control sin quimiocina.
Para la citotoxicidad de las células NK evaluar es importante estandarizar nuestro esfuerzo y las proporciones de objetivo y el tiempo de incubación para cada línea celular de cáncer. Una vez identificadas y validadas las normas, la evaluación in vitro se complementa con experimentos en ratones in vivo para evaluar aún más su papel en la erradicación de células tumorales.
