Este protocolo incluye la fabricación en el sistema optrode para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico. El sistema basado en LED propuesto mejora la eficiencia del acoplamiento de luz a través de una matriz de microlentes. Una fuente de luz LED tiene una configuración de iluminación simple que una fuente de luz láser para que el sistema sea fácilmente aplicable al sistema inalámbrico.
La optogenética es una técnica de camino para comprender la patología de la enfermedad neurológica y los mecanismos de tratamiento. La optogenética se puede aplicar para tratar lesiones de la médula espinal, epilepsia, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. Nuestro dispositivo basado en LED se puede implementar aún más como un sistema inalámbrico con varias ventajas, como la baja complejidad del sistema, la rentabilidad y el bajo consumo de energía.
Primero, conecte el conector hembra de paso de 1,27 milímetros al preamplificador de la etapa principal. Coloque el LED en la carcasa impresa en 3D. Mida la intensidad de la luz en el extremo de la punta de la fibra óptica utilizando un fotodiodo.
Sumergir los electrodos de tungsteno y las fibras ópticas en alcohol durante 15 minutos y secarlos al aire. Afeitar la piel de la cabeza y colocar el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Coloque la cabeza dentro del marco estereotáctico e inserte barras para los oídos en el meato.
Encienda la almohadilla térmica incrustada en el marco estereotáctico y mantenga la temperatura corporal a 37 grados centígrados durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la barra de incisión para ajustar la altura de la barra de incisión y apriete la pinza nasal contra el hocico. Cubra los ojos con vaselina para evitar la sequedad.
Levante la piel de la cabeza con fórceps, asegure un espacio de inyección e inyecte 1% de lidocaína debajo del cuero cabelludo. Realice una incisión sagital con un bisturí y tijeras finas. Sostenga la piel incisa con una microclamp para ampliar la visibilidad del área quirúrgica.
Retire el periostio con hisopos de algodón. Si hay sangrado, cauterice el cráneo usando un bovie para sellar los vasos sanguíneos. Limpie el cráneo con solución salina y marque los sitios de craneotomía con un brazo manipulador.
Perfore un agujero por encima del cerebelo e inserte un tornillo para el suelo. Usando un tornillo de precisión, coloque el tornillo de tierra a 0,5 milímetros de profundidad hasta que llegue a la parte superior del cerebelo. Perfore el área marcada y retire un pedazo del cráneo con fórceps.
Doble la punta de una aguja de calibre 26 en el sentido de las agujas del reloj en un ángulo de 120 grados y exponga el área del cerebro insertando el lado biselado de la aguja hacia arriba. Fije la matriz optrode en el brazo manipulador y muévase cerca del área expuesta. Inserte lentamente la matriz optrode y conecte el tornillo de tierra al cable plateado conectado al sistema.
Inserte espuma de gel entre el cerebro expuesto y el dispositivo para proteger los productos químicos del contacto directo con el cerebro. Aplique cuidadosamente cemento dental en el cráneo para fijar el dispositivo y cubrir la espuma de gel. Antes de que el cemento dental se endurezca por completo, separe el cuero cabelludo si está unido al cemento dental.
Tire de la piel incisa con fórceps para cubrir el cemento dental endurecido y suture el cuero cabelludo. Coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Ajuste la receta de pulso de luz al 4% del ciclo de trabajo en una frecuencia de 10 Hertz.
Configure la estimulación de la luz durante dos segundos durante la grabación neuronal. Retire la cubierta de plástico y conecte la parte superior de los sistemas de suministro de luz con el LED reutilizable en los circuitos. Conecte el preamplificador de la etapa de la cabeza al conector implantado de cinco pines.
Abra el software y configure los filtros de software. A continuación, haga clic y establezca la frecuencia de muestreo del amplificador. A continuación, haga clic en cambiar ancho de banda.
Ajuste el ancho de banda inferior del amplificador y el ancho de banda superior del amplificador. Compruebe el software DAC High-Pass Filter. Abra Spike Scope y verifique las señales neuronales utilizando el umbral de voltaje.
Haga clic en Detener y grabar. Cargue los datos adquiridos mediante MATLAB y compruebe los datos sin procesar. A continuación, ejecute el código de clasificación de picos que contiene el algoritmo de registro de onda.
Compruebe los picos ordenados en el diagrama ráster. Ahora traza los picos de conteo y comprueba los picos evocados durante la estimulación de la luz. La figura muestra formas de onda enteras registradas con condiciones exactas, incluyendo dos segundos de luz en el período en el medio.
El número de picos neuronales individuales evocados después de cada pulso de estimulación de luz aumentó significativamente en comparación con la línea de base con diferentes intervalos de tiempo de dos segundos y 0,2 segundos. La figura muestra un histograma de pico para cada canal antes, durante y después de la estimulación de la luz. La figura del recuadro indica la ubicación de la matriz optrode implantada.
Además, la versión ampliada muestra un histograma de pico con un contenedor de tiempo de 100 milisegundos. La barra azul representa el período de tiempo en que la luz LED estuvo encendida para registrar la respuesta. Para minimizar el ruido del artefacto del proceso de corriente de conducción LED, el sistema debe diseñarse para garantizar una distancia suficiente entre la vía de la señal eléctrica y el circuito LED.
El sistema optrode basado en LED propuesto puede investigar las diversas neurocodiñaciones relacionadas con los comportamientos de los animales porque puede proporcionar estimulación optogenética y registrar las respuestas neuronales evocadas. Una matriz de optrode LED es compatible con la interfaz optogenética inalámbrica, que se puede utilizar en la investigación de animales en movimiento libre.
