El protocolo proporciona una forma sencilla de estudiar las cucarachas americanas. Una plaga sanitaria común y un insecto beneficioso para la medicina tradicional china. Ayudará a explorar los mecanismos moleculares de múltiples actividades de la vida de las cucarachas americanas al derribar genes específicos.
La principal ventaja de esta tecnología es que puede derribar genes en cucarachas americanas u otros insectos similares que no son adecuados para la edición de genes. Esta tecnología se puede utilizar para explorar diversos campos, como la regulación genética y epigenética, el proceso de desarrollo de tejidos, la regeneración de apéndices, el comportamiento de apareamiento y otros lados interesantes de la cucaracha americana. Esta tecnología es fácil de operar y versátil.
Sugerimos mantener a los animales sanos durante el tratamiento de inyección de DSRA. Creo que los novatos pueden dominar fácilmente esta técnica después de varias sesiones de práctica. Para comenzar, separe las ninfas eclosionadas de las ootecas con un tamiz de apertura de cuatro milímetros.
Elija el blanco recién malteado P.americana con un tubo de vidrio. Coloque el P.americana en recipientes nuevos y espere la etapa correcta para el tratamiento. En el sistema de reacción, agregue 10 microlitros de tampón T7 2X, 2 microlitros de la mezcla de enzimas T7 Express y dos microgramos de producto de PCR.
Finalmente, componga el volumen total a 20 microlitros con agua destilada doble. Mezcle suavemente boca abajo manualmente e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos, luego 70 grados Celsius durante 10 minutos. Diluir 4 microgramos por solución de RNasa A de microlitro con agua DEPC en una proporción de 1 a 200.
Luego agregue 1 microlitro de una unidad por microlitro RQ1 RNase Free Dnase y 1 microlitro de solución diluida de RNasa A diluida al sistema. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue el 10% del volumen total de acetato de sodio y tres volúmenes del volumen total de isopropanol.
Mezcle suavemente boca abajo manualmente, luego colóquelo en hielo durante cinco minutos y centrífique a 13, 000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante con una pipeta. A continuación, lave el residuo con etanol al 75%, con un 25% de agua tratada con DEPC, luego centrífuga a 13, 000 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados.
Retire el sobrenadante nuevamente, seque al aire el pellet durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego disuelva el ARN de doble cadena con aproximadamente 100 microlitros de agua DEPC y diluya hasta la concentración final de 2 microgramos por microlitro. Configure el programa en la bomba de microinyección para asegurarse de que el volumen de cada inyección sea consistente.
Luego limpie la jeringa llenándola con agua DEPC de 8 a 10 veces. Instale la jeringa de 10 microlitros en la bomba de microinyección. Luego inicie la bomba y llene la jeringa con 10 microlitros de solución de ARN de doble cadena.
Anestesia las cucarachas con dióxido de carbono, luego recógelas suavemente con pinzas y entrega la cucaracha hacia la aguja a mano. A continuación, inserte la aguja a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis. Inyecte la solución de ARN de doble cadena en la cucaracha asegurándose de que la punta de la aguja esté lo más cerca posible de la epidermis para evitar dañar los órganos internos.
Finalmente, saque la punta de la aguja. Coloque las cucarachas inyectadas en recipientes limpios de bioensayo. Espere unos 10 a 20 minutos para que se recuperen de los efectos del dióxido de carbono.
Etiquete los envases con la fecha de inyección, tipo y dosis de ARN de doble cadena y edad de la P.americana. Se seleccionaron genes Ddc o DOPA descarboxilasa y Dpp o decapentapléjicos como dos ejemplos para observar el fenotipo de las cucarachas malteadas después de la inyección de ARN de doble cadena y dsMocK que no tiene diana en los animales se tomó como control negativo. La eficiencia del ARNi se detectó mediante PCR qRT.
Los genes fueron derribados significativamente con un valor de P de menos de 0,01 para dsDdc y menos de 0,05 para dsDpp. P.americana con genes Ddc de derribo tenía la epidermis blanca debido a la melanización bloqueada. En el experimento con inyecciones de dsDpp, el ARNi interrumpió la regeneración de las extremidades.
Los insectos deben estar sanos e inyectados sin daño. Esta tecnología proporciona una forma sencilla de explorar las funciones genéticas de los insectos que no se pueden editar genéticamente, como la cucaracha americana.
