We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. Síntesis y Preparación dsRNA <ol><li> Identificar una región de derribo 200-800 pb (para generar el correspondiente ARN de doble cadena) dentro del gen de interés que se prevé que no tienen efectos fuera de la meta identificables (por ejemplo, hay una homología de secuencia ≥18 pb dentro de otro gen) y un control negativo (por ejemplo, , una secuencia heteróloga que no está presente dentro del genoma de insectos objetivo, tal como el gen lacZ de Escherichia coli (GenBank gene ID: 945006). como alternativa, utilizar un control positivo (por ejemplo, que produce un fenotipo fácilmente observado, como SRPN2 21,22 , GenBank gene ID:. 1270169) la secuencia de la SRPN2 orientación dsRNA se define en Michel et al (2005) 21.. Nota: E-ARNi es un recurso bioinformático de código abierto que es útil para la identificación de estas regiones y para el proceso de diseño de cebadores de oligonucleótidos 23. </li><li> realizar samplificación tandard PCR (es decir, realizada con la Taq ADN polimerasa usando 30-35 ciclos) utilizando un ADN genómico o cDNA plantilla para obtener la síntesis de plantilla de dsRNA flanqueado por una secuencia de promotor T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) y proceder con la preparación de dsRNA y limpiar-up utilizando un kit comercial transcripción in vitro según las instrucciones del fabricante. Uso SRPN2 PCR condiciones de amplificación y cartilla de información que se presenta en An et al. (2011) 22. </li><li> Cuantificar el rendimiento de ARN de amplicón purificado por espectroscopia de absorción ultravioleta a longitud de onda de 260 nm y ajustar a la concentración deseada (por ejemplo, 3 g / l) en agua libre de RNasa. <ol><li> Para solucionar los problemas bajas concentraciones de ARN, reducir el volumen de líquido haciendo girar las muestras en una centrífuga de vacío a temperatura ambiente o por liofilización de muestras y la reconstitución en volúmenes más pequeños de agua. El tiempo necesario para la liofilización de la muestra variará dependiendoen los volúmenes iniciales de la muestra y las concentraciones de ARN de doble cadena. </li></ol></li><li> Comprobación de la calidad y la longitud del dsRNA en un gel de agarosa al 2% preparada con 1x TBE o tampón TAE y se tiñeron con bromuro de etidio (EtBr), junto con la plantilla de ADN utilizado para la reacción de transcripción. El dsRNA migrará más lentamente que la plantilla de ADN. Calidad y la duración pueden ser evaluados al asegurar que no hay productos no específicos y ARN de doble cadena mediante la comparación de productos con un marcador de ADN estándar, respectivamente. Nota: EtBr es un potente mutágeno y debe ser manejado en consecuencia. Nota: A una concentración dsRNA de 3 g / l, 0,5 l de la muestra es más que suficiente para la visualización en el gel de agarosa EtBr-manchado. </li><li> Almacenar dsRNA a -20 ° C hasta que se necesite. ciclos de congelación / descongelación múltiples pueden causar la degradación, por lo alícuotas deben estar preparados para grandes volúmenes de ARN de doble cadena. </li></ol> 2. Preparar Fast Green FCF Dye tubos (FGD) <ol><li> Diluir rápida de tinte verde FCFa partir de la solución madre (≥85% de contenido de colorante) a 0,1% (v / v) (solución de trabajo) en agua libre de RNasa. </li><li> Pipeta de 1 l de medio de contraste en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Colocar los tubos en un bloque de calor a 65 ° C durante aproximadamente 3 horas para evaporar, luego coloque los tubos de líquidos a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, enfriar antes de usar. Este colorante sólido seco se reconstituirá en solución de resuspensión ARN de doble cadena. </li></ol> 3. Tire las agujas de inyección <ol><li> Tire de agujas de vidrio de borosilicato con un extractor de aguja calentada a un diámetro de la punta de 10-30 micras. Tire ajustes corresponden a: el ajuste del calentador no. 1 = 100, el ajuste del calentador no. 2 = 70. </li><li> Para evitar daños a la fina punta de la aguja, colocar todas las agujas tirados horizontalmente en una placa de Petri en una tira de masilla de moldeo. Nota: Información adicional de la aguja capilar tirando métodos se puede encontrar con más detalle en el Reactivo de Investigación y Referencia del Centro de Recursos malaria MR4 manual de 24. </li></ol> 4. Preparar la estación de inyección <ol><li> Recoger los materiales necesarios: agujas microcapillary vidrio sacaron a punta fina, microinyector, papel de filtro fino y papel de filtro grueso, placas de Petri, pipetas de transferencia, pincel y el microscopio de disección luz. </li><li> Preparar el microinyector como se indica en el manual microinyector, y establecer el volumen de inyección al volumen deseado por pulso (por ejemplo, máximo de 69 nl por pulso). </li><li> En una plataforma que es fácil de maniobrar bajo el microscopio (por ejemplo, el lado plano de un bastidor de tubo de espuma de poliestireno), apilar las dos hojas de papel filtro con el papel de filtro delgado en la parte superior, y seguro con cinta adhesiva alrededor de los bordes. </li><li> Resuspender 10 l de cada solución de ARN de doble cadena en tubos de teñir de colores distintos, y el lugar en el hielo. </li></ol> 5. Recoger pupas para Inyección <ol><li> Llenar una pequeña de 60 mm x 15 mm placa de Petri con 10 ml de agua desionizada, y recoger ~ 50 pupas pálido (During de la primera 24 horas después de la fase de pupa) de una bandeja insectario con una pipeta de transferencia de plástico desechable. </li><li> Eliminar cualquier pupas que tienen medio de bronceado oscuro de la cutícula. Nota: Una vez que la cutícula comienza a broncearse, se hace más difícil de penetrar la cutícula, y los resultados de inyección en mucho mayor letalidad. </li></ol> 6. inyección de dsRNA <ol><li> Bajo el microscopio de disección, rompa la punta distal de la aguja de inyección con un par de pinzas finas. </li><li> Preparar la aguja de inyección por el relleno de la aguja con aceite mineral (usando una jeringa con una 3 pulgadas, aguja de calibre 30), y expulsar el exceso de aceite con el microinyector. </li><li> Frente llenar aguja de inyección con la máxima cantidad de ARN de doble cadena, y expulsar un pulso bajo el microscopio, asegurar la distribución del líquido. En el caso de que ningún líquido es absorbido y / o expulsado, compruebe la punta distal de la aguja en busca de obstrucciones y asegurarse de que la aguja está bien colocada en el microinjector. </li><li> Escoja 1-3 pupas, y colocarlos en el papel de filtro. </li><li> Utilizando el pincel, la posición de las pupas en el papel de filtro con la cutícula dorsal accesible, y utilizar el pincel para empujar sobre papel de filtro y absorber cualquier exceso de agua. </li><li> Estabilizar la pupa con la punta del pincel, e inserte la aguja en la cutícula dorsal entre el tórax y el abdomen en un ángulo de aproximadamente 30 ° en relación con la superficie dorsal de la pupa. La inyección debe ser dirigido hacia el extremo posterior de la pupa y la aguja se debe mover en una dirección anterior-a-posterior. </li><li> Inyectar dos impulsos (69 nl por impulso) de solución de 3 g / l ARN de doble cadena en la hemolinfa, y comprobar la distribución del color en todo el cuerpo. Si no se identifica el color, cambiar la posición de la aguja de inyección ligeramente para vaciar la punta de la obstrucción y repetir de suministro de líquido. </li><li> Con el pincel humedecido para mover suavemente las crisálidas de la aguja en el agua para el cultivo. Tpupa que debe atenerse a la brocha al entrar en contacto la luz. </li></ol> 7. Condiciones después de la inyección <ol><li> Coloque placa de Petri con pupas se inyecta en una jaula de mosquitos con el flujo de aire adecuado (por ejemplo, la jaula de malla o un recipiente con tapa de malla). condiciones de cría de pupas deben permanecer constantemente a 27 ± 3 ° C de temperatura, 75 ± 5% de humedad y estar bajo un ciclo de luz: oscuridad de 16: 8 h. </li><li> Preparar una solución de glucosa al 10% (w / v), y colocar una bola de algodón solución saturada en la jaula de malla de mosquitos para la alimentación de adultos. </li></ol> 8. Evaluar Derribo <ol><li> Al momento de punto (s) deseada, evaluar fenotipos en experimentales insectos inyectados con ARN de doble cadena, en comparación con los controles. <ol><li> Evaluar dsSRPN2 y dsLacZ insectos diaria enfriando hasta adultos durante aproximadamente 2-3 minutos a -20 ° C, transferirlos a un plato frío entre 2 ° C y la identificación de cualquier formación de pseudo-tumor mediante la utilización de un microscopio de disección a 15Xaumento con iluminación de campo claro. Después de la evaluación, los adultos a las condiciones de insectario (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% de humedad) de regreso. Nota: Los dsRNAs experimentales y de control utilizados en este protocolo son dsSRPN2 y dsLacZ, respectivamente. Hay muchas opciones para los controles adecuados; sin embargo, se sugiere que un control positivo para la que se visualiza fácilmente fenotipo y / o la expresión (por ejemplo, mediante la disección de la microscopía) y / o cuantificado [por ejemplo, cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR), Western blot] se debe utilizar cuando el aprendizaje de esta técnica. SRPN2 proteína y cuantificación transcripción a través de Western blot y QRT-PCR, respectivamente, se describen en Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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Los métodos actuales para inducir el ARNi no transgénico en los mosquitos implican la inyección directa de ARN de doble cadena en el hemocoel adulto 12,13 o alimentación de las larvas de RNAi nanopartículas recubiertas de activación 14-17 o ARN de doble cadena a base de microalgas moléculas 18. Apuntando al mosquito adulto, aunque es extremadamente valiosa, puede excluir a un gran número de genes que funcionan durante los períodos anteriores del desarrollo. Caída iniciada por alimentación de las larvas puede producir fenotipos inconsistentes durante la etapa adulta, debido, en parte, a la posibilidad de la persistencia de proteínas a través de la variable de estado de pupa. Por lo tanto, se introduce un método adicional que se dirige específicamente a iniciar RNAi durante el desarrollo de pupa proporcionará un medio para evaluar más a fondo las funciones de genes durante las etapas de desarrollo pre-adultos, así como capacidades mejoradas para evaluar la función génica durante la etapa adulta. Como con enfoque de genes desmontables basado en la inyección de dsRNA o expresión, la persistencia del gen desmontablesno se puede predecir. Por lo tanto, los niveles de transcripción o proteínas deben ser evaluados para el gen de interés durante períodos de desarrollo de interés. Aunque se observa una continuación de la disminución de los niveles de proteína en el día 5 después de la inyección para SRPN2 en los animales inyectados con ARN de doble cadena SRPN2, factores como el recambio de proteínas y la vida media pueden ser diferentes para diferentes objetivos. Es fundamental para garantizar, además, que el ARN de doble cadena que se utilizará para la inyección es bien concentrado y parece intacto en un gel de agarosa. Recomendamos experimentadores reevaluar estos factores si los resultados no son suficientes desmontables, y pueden necesitar ser probado empíricamente para objetivos de genes específicos respectivas concentraciones de ARN de doble cadena. Se describe un método para la iniciación de la interferencia de ARN durante la fase de pupa de An. desarrollo gambiae. Este método se basa en la introducción a través de microinyección de dsRNA directamente en el hemocoel de pupas temprano y permite la evaluación de la calidad de la inyección por elutilizar de dsRNA marcado con colorante. La capacidad de visualizar la calidad de inyección constituye una mejora fundamental para garantizar knockdown éxito y constituye un aspecto de la caída génica basada en la inyección que no se ha considerado en los protocolos basados ​​en dsRNA más informes anteriores se centran en la etapa adulta. Al dirigirse a la pupa en el inicio de este periodo de desarrollo, los genes que podrían desempeñar un papel durante este intervalo crítico del desarrollo, o durante las primeras etapas de la edad adulta se puede evaluar funcionalmente. Además, este método puede permitir la entrega dsRNA a las células, y el establecimiento de la interferencia de ARN en las células que son accesibles durante la metamorfosis, pero menos accesibles en mosquitos adultos completamente formados. Un análisis de microarrays reciente de Harker et al. (2012) identificó 560 An. gambiae transcripciones que fueron hasta reguladas o hacia abajo-regulados por al menos 4 veces durante las etapas de desarrollo distintas, que van desde el embrión a adulto. De los 560 transcripciones identificado, un conjunto de 309 fue hasta reguladas durante el desarrollo de pupa 27. Estos hallazgos sugieren que hay muchos requisitos para la expresión diferencial de genes en todo el desarrollo de mosquitos, incluyendo aquellos que se producen durante la fase de pupa, un intervalo durante el cual el organismo sufre metamorfosis. En muchas especies de insectos, incluyendo An. gambiae, genes implicados en procesos tales como el desarrollo (es decir, cuticular de pupa y proteínas de unión a quitina) 27-31 y la respuesta inmune (es decir, las proteínas similares al receptor de tipo Toll) 27,32-34 son altamente expresado durante la fase de pupa. Una vez que ha surgido un adulto completamente formado, no se continúa la expresión génica en respuesta a ambiental y fisiológica cambia 35. Cabe destacar que, durante el desarrollo adulta temprana, hay un aumento en la expresión de genes del desarrollo (es decir, cuticular de adultos y proteínas sarcoplásmicas) 36, así como otros genes clave (es decir, </em&gt;, La proteína específica del esperma y del citocromo P450 enzimas del metabolismo) 27,36. El control positivo utilizado en el desarrollo de este protocolo, SRPN2, es un An. gambiae inhibidor de serina proteasa (serpina). SRPN2 juega un papel importante en la regulación negativa de la melanización de insecto, una respuesta inmune innata amplio espectro en insectos 21,22. Desmontables de SRPN2 en mosquitos adultos en los resultados de la formación de pseudo-tumor 21,22, un fenotipo que se observa fácilmente mediante el uso de microscopía de luz. Dado que este fenotipo distinto puede ser fácilmente anotó en insectos vivos, se utilizó para las inyecciones SRPN2 fase de pupa RNAi iniciales. Además, SRPN2 se expresa durante todas las etapas de desarrollo 37, proporcionando de este modo un buen objetivo para la fase de pupa inyección RNAi y evaluación de la función a principios del adulto. Se demuestra que el método que hemos desarrollado es capaz de inducir pseud melanótica adulta similares<html> la formación de o-tumor como consecuencia de las inyecciones de dsRNA realizadas durante la fase de pupa de desarrollo. En el desarrollo de este protocolo, hemos observado que la inyección durante el desarrollo temprano de pupa (es decir, las primeras 24 horas después de la muda larval-pupal) es fundamental para la obtención de emergencia de los adultos óptima. En el caso de que los pobres emergencia se obtiene después de la inyección, se recomienda la estadificación larvas con mayor precisión, para obtener pupas con menos extensa endurecimiento cutícula y asegurar la inyección se consigue fase de pupa temprano. Además, minimiza el daño a los resultados de la cutícula en tasas de emergencia óptimos y aumentando la ampliación durante la inyección puede ayudar a asegurar que sólo la región que el animal está pinchada. Si la aguja debe perforar a través de la cutícula ventral, puesta en común de líquido marcado con colorante será evidente en el exterior de la pupa o saturará el papel de filtro. Es muy recomendable para descartar cualquier pupas que tienen más de una punción de la cutícula. jove_content &quot;&gt; Con las amplias experiencias de muchos laboratorios con el desempeño de las inyecciones de mosquitos adultos, los enfoques de microinyección previamente identificados se puede adaptar con modificaciones de protocolo sencillas para su uso en experimentos de RNAi pupa. En general, el objetivo de este método es proporcionar a los investigadores la capacidad de ampliar el período de tiempo durante el cual los análisis genéticos pueden llevar a cabo, lo que permite una mayor investigación que apoyará el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores inversa. Curiosamente, los experimentos en otras especies, como el Rhodnius prolixus, Spodoptera frugiperda, revelan que el gen efectos de silenciamiento tienden a ser mucho mayor cuando se inicia durante la pre-adulto etapas 38,39. durante todas las etapas de desarrollo, gen mediada por RNAi desmontables está sujeta a consideraciones relativas a la rapidez y la persistencia del silenciamiento de genes, y la estabilidad de las proteínas codificadas por los genes objetivo. el objetivo ideal RNAi los genes tienden a ser las que codifican una protein o ARN que tiene una vida media corta y elevada tasa de rotación 11,40. Aunque las estrategias de RNAi transgénicos también pueden ser empleados para tratar las consideraciones con respecto a la rapidez y la persistencia de la RNAi durante las etapas de pre-adultos, técnicas transgénicas tienen muchos inconvenientes (por ejemplo, tiempo requerido para la generación de líneas transgénicas, experimentales calendarios de apareamientos de mosquitos para generar insectos con la expresión de ARN de doble cadena regulada, y el mantenimiento de las poblaciones de transgénicos). Por el contrario, nuestro protocolo proporciona un método más fácil y más rápido para iniciar la precipitación génica durante el desarrollo de pupa y en tipos de células que se originan y que son accesibles durante la metamorfosis, pero son menos accesibles en los adultos. El uso de suspensiones de dsRNA marcados con colorante permite una fácil evaluación del éxito de la inyección y la dispersión del material introducido dentro de las pupas. Nuestros datos sobre la aparición de la formación de tumores en adultos de pupa inyectado, en comparación con los animales inyectados como adultos, es coherente con initiation de RNAi mediada desmontables durante la fase de pupa. El uso de nuestra línea G3 mosquitos y bajo nuestras condiciones de insectario, se observa la formación de pseudo-tumor melánico adulta a los 10 días después de la inyección de adultos inyectó tres a cinco días después del brote. Mediante la realización de la inyección temprana de pupa-etapa, se observa la formación de melanotic pseudo-tumor visible ya en cinco días después de la inyección (es decir, de tres a cuatro días después del brote). Estos datos implican que este método permite la iniciación de knockdown de genes durante un período de desarrollo anteriormente con-estudiado (es decir, el desarrollo de pupa). Nuestro método de etiquetado de tinte también puede resultar útil para el desarrollo de nuevos protocolos de inyección de larvas, debido a la naturaleza translúcida de la cutícula durante todos los estadios larvales. Mientras que el control utilizado en este estudio requiere progresión en la etapa adulta para mostrar un fenotipo desmontables, futuros experimentos para evaluar fenotipos pupa etapa específica después de la inyección de pupas temprano proporcionaráinformación valiosa con respecto a la expansión de este método en unos periodos de desarrollo adicionales, tales como el desarrollo de pupa tarde. En resumen, este método proporciona un protocolo de ARNi valiosa para la iniciación de la fase de pupa gen desmontables mediante RNAi y amplía las herramientas de genómica funcional para su uso dentro de la comunidad de investigación insecto vector.

La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos que afecta a muchos millones de personas cada año. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que en 2013 había aproximadamente 584.000 muertes debidas a la malaria, el 78 por ciento de los cuales ocurrieron en niños menores de cinco años 1. Los patógenos que causan la malaria humana son parásitos apicomplejos dentro del género Plasmodium y se transmiten entre sus huéspedes humanos por los mosquitos Anopheles hembra. La transmisión se produce cuando el mosquito ingiere sangre de un individuo que está infectado, y luego los depósitos parásitos infecciosos en un individuo no infectado en una comida de sangre posterior. Dentro del género Anopheles, Anopheles gambiae es la especie de mayor capacidad vectorial y es el vector de la malaria más prominente en el África subsahariana 1-3. Actualmente, mosquito vector de control por el despliegue de insecticidas continúa a be el principal método empleado para reducir la carga de la malaria humana. Aunque el uso de insecticidas desde 1960 ha demostrado ser un gran éxito, el aumento de la resistencia a los insecticidas ha conducido una necesidad para el desarrollo de nuevos insecticidas y estrategias de control de vectores alternativa 4-7. Durante el año 2010, un total de 49 de los 63 países que comunicaron a la OMS indica la aparición de resistencia a los insecticidas en los vectores de la malaria 1. Además, la herramienta IR Mapper, que utiliza la literatura revisada por expertos para evaluar los datos de resistencia en las regiones de África tropical, informa que entre 2001 y 2012 hubo 46% y el 27% aumento de la resistencia a los piretroides y diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente 7. La interferencia de ARN (RNAi) fue identificado en la década de 1990 como una técnica que se podrían emplear para inactivar genes en la planta Petunia 8,9 y en el hongo Neurospora crassa 9,10. Poco después,en 1998, el ARNi se documentó por primera vez en Caenorhabditis elegans como un medio de reducir la expresión génica en un modelo animal mediante la introducción de antisentido o ARN de doble cadena (dsRNA) a través de inyección o métodos de alimentación 9,11. Desde su descubrimiento, el ARNi ha revolucionado la búsqueda de la genómica funcional, permitiendo a los investigadores utilizan la genética inversa para investigar rápidamente el papel funcional de los genes de interés a través de un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional altamente selectiva. En algunos organismos, tales como Drosophila melanogaster, el uso de los organismos transgénicos que expresan constructos de ARN de interferencia ha sido ampliamente exitosa para gen desmontables (KD). Aunque el uso de transgenes en An. gambiae de ARNi se ha utilizado y puede resultar útil para pantallas de gran escala, la generación de cepas de mosquitos transgénicos es tanto trabajo y tiempo intensivo, generalmente toman de dos a tres meses para pasar de la identificación de un gen de interés para los Generatien planta de un almacén transgénica apropiada 12. Actualmente, el método primario de KD gen en An. gambiae es por inyección en la hemolinfa, durante la etapa de adulto, de dsRNA específico para un gen dado 12,13. Este proceso generalmente tarda aproximadamente un mes para ir desde la identificación de un gen de interés a la evaluación de KD gen, demostrando ser mucho más rápida que los métodos transgénicos 12. Los métodos para larvas en etapa de ARNi se han establecido recientemente en una. ARN de doble cadena a base de microalgas gambiae y Aedes aegypti a través de la alimentación de nanopartículas 14-17 o mediante la administración oral de moléculas 18, ofreciendo oportunidades para llevar a cabo el análisis genómico funcional durante las primeras etapas de desarrollo. En la inyección directa, la alimentación, y los métodos de liberación de nanopartículas, dsRNA se recoge de forma autónoma por la célula diana y se escinde por la enzima Dicer en 21-25 nucleótidos de longitud &quot;corto de interferencia ARN&quot; (siRNAs) 19,20. Estos siRNAs son entonces incorado en el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), de la que se descartará una hebra, permitiendo que el complejo RISC ARN unido para unirse y escindir el ARNm objetivo y por lo tanto reducir su nivel e inhiben su traducción 19,20. Muchas de las características intrínsecas de la biología básica de mosquitos modulan la capacidad vectorial, incluyendo la preferencia de acogida (por ejemplo, el olfato, gustation), el apareamiento, la reproducción y la inmunidad. Dada la importancia de estos procesos biológicos, es probable que su modulación a nivel genético o farmacológico ofrecerá nuevas oportunidades para el control de vectores, incluyendo la elusión de resistencia a los insecticidas, y proporcionar nuevas herramientas para enfoques más ampliamente integrados para el manejo de vectores. El uso de la genómica funcional para evaluar las funciones de los genes que subyacen a estas características biológicas intrínsecas permitirá la identificación de nuevas dianas y proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo podemos crear efectivamente nuevos, strateg control más efectivoIES. Se describe el desarrollo y el uso de un método de inyección rápida para iniciar RNAi durante la fase de pupa de An. gambiae. Observamos que la inyección estado de pupa de un disparador de ARNi permite la observación de los fenotipos resultantes en adultos en fase inicial, es decir, cuanto antes después de la emergencia de lo que se observaría si gen desmontables se iniciaron en adultos después del brote. Este método permite gen desmontables que comienza durante el intervalo del desarrollo de pupa y que se extiende en etapas adultas, tales principios adultos tipos de células de la hemolinfa de ruedas que desmontables gen iniciado durante el desarrollo pupal puede persistir y afectar, así como los tipos de células que son más hemolinfa de ruedas durante la metamorfosis que en el adulto, como las neuronas sensoriales que se encuentran en apéndices adultos siguientes emergencia.

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II foot switch</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glass micropipette puller</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>&amp;frac14; inch cut from tip to create a wider opening.</td></tr><tr><td>Whatman &amp;ldquo;thin&amp;rdquo; filter paper&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td></tr><tr><td>Western blot &amp;ldquo;thick&amp;rdquo; filter paper</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td></tr><tr><td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush (size 0)</td><td>Michael&amp;rsquo;s Art</td><td>10474940</td><td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td></tr><tr><td>Dissecting light microscope</td><td>&amp;nbsp;----&amp;nbsp;</td><td>-----</td><td>This can vary based on availability and user preference.</td></tr></tbody></table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

La inyección de pupa para los rendimientos gen KD resultados óptimos cuando se realiza la inyección durante la fase de pupa temprano, cuando los niveles de bronceado de la cutícula son bajos (Figura 1A, izquierda y 1B). El aumento de bronceado y el endurecimiento de la cutícula, generalmente después de 24 horas, resulta en aumento de la muerte de pupa después de la inyección (Figura 1A, central y derecho). La tasa de desarrollo de pupa puede variar dependiendo de las condiciones de insectario y la densidad de animales 24,25; Por lo tanto, lo mejor es evaluar visualmente la pigmentación. Durante el proceso de inyección, la aguja capilar se inserta en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 ° en la zona anterior a la dirección posterior (Figura 2A). Una vez que se inserta la aguja y la dsRNA + 0,01% (w / v) se dispensa FGD, la distribución de colorante es evidente a través de la hemolinfa (Figure 2B). Evaluación de la emergencia de los adultos para pupas inyectado con 0,01% (w / v) FGD reveló una tasa promedio de 70% de emergencia, en comparación con 96,7% de emergencia de los controles no inyectados (Figura 3A). Es de destacar que se observó aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no supervivientes (Figura 3B). Animales inyectados no presentan retrasos en el tiempo de la emergencia (Figura 4A) o sesgada de impacto en ambos sexos (Figura 4B). La evaluación adicional de la supervivencia de adultos lleva a cabo hasta el día 10 después del brote revela que no hay impacto evidente en post-emergencia de supervivencia de adultos (Figura 4C). La validación de la calidad de KD se evaluó por el pseudo-tumor melanotic (cluster tejido pigmentación oscura) fenotipo asociado con SRPN2 desmontables 21,22 como un control positivo para knockdown y la<html> ausencia de fenotipos asociados con la inyección dsLacZ como control negativo. Los mosquitos adultos que emergieron fueron anotados en el día 8 después de la inyección (día 6-7 post-emergencia). Se observaron pseudo-tumores melánicos (Figura 5A y 5B) a través de la cutícula del 93,5% de la dsSRPN2 vs. 0% de los mosquitos dsLacZ adultos (Figura 6A). Agrupaciones de tejido oscuro melanizados se identificaron en la disección de los parches pigmentados (Figura 5C). Pseudo-tumores eran visibles en la cutícula de adultos ya en el día 3 post-emergencia y también estaban presentes en un subconjunto de dsSRPN2 hemolinfa y los tejidos intestinales (datos no mostrados). A las 5 de post-inyección (etapa adulta temprana), disminuyó significativamente los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no se observó dsLacZ o aislados de proteína no inyectados hemolinfa (Figura 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: puesta en escena del Desarrollo para la inyección de dsRNA inyección de pupa pupa temprana de los resultados de ARN de doble cadena en la supervivencia y la progresión óptima en la etapa adulta.. Los bajos niveles de pigmentación de la cutícula (A, a la izquierda, y B) se pueden observar dentro de la primera 0-24 horas después de la fase de pupa. Curtido de la cutícula precedente inyección de pupa resultados (derecha A, centro y) de moderada a baja supervivencia. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Figura 2:. Posición de inyección y la distribución de inyección de la aguja dsRNA (A) marcado con colorante capilar de dsRNA marcado con colorante en la cutícula dorsal en un ángulo de aproximadamente 30 °, en dirección anterior a posterior. (B) El medio de contraste se distribuye de forma visible en la hemolinfa de pupa. volumen de inyección de dsRNA de 138 nl, marcado con 0,01% FGD (w / v). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Figura 3:. Post-inyección emergencia del adulto (A) 70% de pupas inyectado con 0,01% FGD (w / v) emergió con éxito (n = 60), en comparación con 96,7% de los controles no inyectados (n = 60). Se realizaron tres réplicas biológicas. Se observó (B) aparición parcial de la caja de pupa para un gran número de mosquitos no sobrevivir. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Figura 4: la tasa de emergencia, la evaluación sexo y adultos supervivencia (A) se observaron tiempos de emergencia comparables después de la inyección de pupa con 0,01% FGD (24 hr = 80% y 48 hr = 20%), en comparación con pupas no inyectado (24. HR = 83% y 48 hr = 17%). (B </strong&gt;) se observó Aproximadamente igual hombres y mujeres adultos surgimiento de 0,01% FGD pupas inyectado (mujer = 48% y hombres = 52%) y pupas no inyectado (mujer = 52% y hombres = 48%). Análisis (C) Supervivencia revela que la inyección con 0,01% FGD no afecta la supervivencia de adultos, evaluada hasta 10 días después del brote. Los resultados representan datos de tres experimentos independientes con 0,01% FGD inyectado (n = 60) y pupas no inyectado (n = 60) (igual número de machos y hembras). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Figura 5: Pseudo-tumoral fenotipo control positivo refleja caída éxito se observaron pseudo-tumores en el abdomen (A) y (B) de la cutícula torácica de dsSRPN2: se inyecta, pero no dsLacZ mosquitos adultos inyectadas en el día 8 después de la inyección..(C) aumento mayor (400X) de formación de imágenes (a) de la cutícula y la disección de los parches pigmentadas (b) revela grupos de células oscuramente melanized. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Figura 6: La cuantificación de la formación de pseudo-tumor y la disminución de los niveles de proteína SRPN2 (A) inyecciones fase de pupa resultan en la formación de pseudo-tumor en 93,5% de los adultos dsSRPN2 (n = 21) en comparación con 0% de los controles dsLacZ (n = 19). . Los resultados obtenidos el día 8 después de la inyección. (B) Western blot (izquierda) muestra una disminución en los niveles de SRPN2 dsSRPN2, pero no dsLacZ o aislamientos no inyectados proteínas hemolinfa (día 5 después de la inyección). Resultados basados ​​en tres experimentos independientes. Anti-SRPN2 21 y anti-SRPN3 diluciones 26 anticuerpos utilizados fueron 1: 1.000 y 1: 2.000, respectivamente. Cabra anti-raBBIT IgG-HRP (Producto sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) se utilizó a 1: 5000. Todos los niveles de proteína se cuantificaron (derecha) por la intensidad de banda (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalizado a SRPN3, y estadísticamente comparado con la prueba t no pareada. P &lt;0,05: *, P ≥0.05: ns (no significativo). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

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RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K vistas.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Investigación

Genética

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biología

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Medio ambiente

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Mosquito Embryo Microinjection: A Technique to Deliver Exogenous DNA into Embryo Yolk of Anopheles Gambiae to Generate Germline Mutations

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62591">Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the delivery of gene drive construct into the embryo of Anopheles gambiae mosquito through embryo microinjection technique. This procedure allows for integration of&#160; delivered DNA construct, through homologous recombination, into the germline cells to generate transformed mosquito population.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the ...

RNAi gatillo en la entrega

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Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,