La estimación de un nivel de calcio presináptico es una tarea clave en el estudio de la transmisión sináptica. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas. La principal ventaja de la técnica de carga presentada es que la tinción se ha realizado solo para las células de interés.
Nuestro método para registrar la intransiencia del calcio proporciona una resolución espacio-temporal extremadamente buena. El método de registro presentado puede ser útil para los neurofisiólogos que necesitan registrar procesos periódicos rápidos utilizando un microscopio confocal. El paso más difícil en la técnica de carga es mantener el nervio dentro de la pipeta.
El diámetro de la pipeta debe ajustarse perfectamente, así que haga algunas varias. Conocer todos los pasos del protocolo es complicado y demostrar cada uno de ellos ayudará mucho. Comience fijando el tejido muscular elevador del auris largo de una manera ligeramente estirada en la placa de Petri recubierta de elastómero con los finos pasadores de acero inoxidable y agregue la solución de Ringer al plato hasta que el músculo esté completamente cubierto.
A continuación, utilice un extractor de micropipetas para preparar una micropipeta con una punta fina y afilada para las grabaciones intracelulares. Utiliza capilares sin filamentos internos. Después de marcar el cono con un abrasivo, rompa la punta de la micropipeta, dejando una punta abierta a unos 100 micrómetros de diámetro.
Luego, pulir la punta a fuego hasta que el diámetro interno se reduzca de 80 micrómetros a 12 micrómetros. Cuando haya terminado, conecte un tubo de silicona a un lado y una jeringa sin aguja al otro lado de la pipeta de llenado. Bajo un microscopio estereoscópico, encuentre dónde el tronco nervioso se convierte en ramas nerviosas separadas.
Coloque la pipeta de relleno en la placa de Petri con cera y, a continuación, mueva la punta de la pipeta hasta que quede por encima del nervio. Corte el nervio cerca de la fibra muscular con tijeras finas, dejando un pequeño trozo del muñón nervioso, de aproximadamente un milímetro de largo. Luego, aspire el muñón del nervio con un poco de solución de Ringer en la punta de la pipeta de relleno, sin pellizcar el nervio.
Una vez hecho esto, retire el tubo de silicona de la pipeta de relleno. Más tarde, use una jeringa con un filamento largo para extraer la solución de carga de tinte. Luego, inserte la punta del filamento con la solución de carga en la pipeta de relleno y suelte la mezcla en el muñón nervioso, seguido de incubar la preparación nerviosa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
Después de la incubación, enjuague la preparación nerviosa con una solución de Ringer fresca antes de tratarla con 50 mililitros de solución de Ringer en un vaso de precipitados de vidrio a 25 grados centígrados durante dos horas. Para la microscopía confocal, monte la preparación nerviosa en una cámara experimental recubierta de elastómero de silicio y fíjela, ligeramente estirada, con un conjunto de microagujas de acero. Luego, enjuague la preparación extensamente con la solución de Ringer.
Instale un electrodo de succión en la cámara. Después de montar la cámara de preparación en la etapa del microscopio, coloque los accesorios de entrada y salida en la cámara. Encienda un sistema impulsado por flujo por gravedad para eliminar el exceso de solución de la preparación.
Una vez hecho esto, conecte el electrodo de succión estimulante en un estimulador eléctrico y asegúrese de que las contracciones musculares ocurran después de los estímulos. Luego, llene el sistema de perfusión con la solución de Ringer que contiene 10 d-tubocurarina micromolar y encienda la bomba de succión de perfusión para comenzar la perfusión. En el microscopio confocal de barrido láser, o software LSCM, elija electrofisiología y modo de adquisición para establecer los parámetros de imagen.
En la configuración del menú de trabajo, seleccione la configuración del disparador para activar el estimulador con el pulso de sincronización del microscopio y establezca el disparador en el campo de fotograma en el canal OUT 1. Cambie el modo de escaneo a XYT a una frecuencia de escaneo de 1, 400 hertzios. El factor de zoom debe ser 6.1 con el agujero de alfiler completamente abierto.
Asegúrese de que el modo X secuencial, transdireccional y bidireccional esté activado, a continuación, establezca el tiempo mínimo para formar un fotograma en 52 milisegundos y recopile fotogramas en un vídeo sin procesar a 20 fotogramas. Ajuste la longitud de onda de excitación del láser de argón a 488 nanómetros con el 8% de la potencia de salida. Cuando se establezcan los parámetros, presione el botón de modo en vivo para obtener una vista previa en vivo de los terminales nerviosos cargados con el tinte.
En el modo en vivo, busque la región de interés, o ROI, para obtener el mejor enfoque. Luego, cambie el retraso en el estimulador en dos milisegundos menos en relación con el valor anterior y ejecute el software de adquisición de datos para adquirir 26 secuencias cambiando cada secuencia dos milisegundos de la anterior. Para procesar los vídeos capturados, ejecute el software Leica Application Suite X o LAS X y abra el proyecto creado.
Luego, haga clic en exportar y guardar como para guardar fotogramas en formato TIF en la carpeta de destino. A continuación, ejecute el software ImageJ y haga clic en archivo, importación y secuencia de imágenes. En la ventana Abrir secuencia de imágenes, elija la carpeta de destino y abra el primer fotograma.
En las opciones de secuencia, vaya al campo de imagen inicial y establezca el número de fotograma en uno para el primer fotograma. A continuación, en el campo de incremento, establezca el valor igual al número de fotogramas en la grabación de señal inicial antes de hacer clic en Aceptar. Para guardar el archivo generado de los primeros fotogramas cosidos en una carpeta separada, haga clic en las pestañas archivo, guardar y carpeta en orden.
Repita los procedimientos para 19 fotogramas estableciendo el número de fotograma correspondiente en el campo de imagen inicial. Cuando se obtengan todas las imágenes, haga clic en archivo, importación y secuencia de imágenes para seleccionar una en los campos de imagen inicial e incremento. Se puede ver el video final con todos los fotogramas unidos a mayor resolución temporal.
Luego, guarde el archivo de video en formato TIF. Para analizar el video cosido, haga clic en imagen, pilas, herramientas y clasificador de pilas. Luego, vaya a análisis, herramientas y administrador de ROI.
Arrastre y suelte el archivo TIF guardado anteriormente en la ventana ImageJ y luego expanda la imagen para una mejor vista. Para mejorar la visualización de la imagen, haga clic en imagen, ajustar, para convertir el contraste de brillo en automático. Establezca el fondo cerca de la terminal nerviosa dibujando ROI y agregando valor al administrador de ROI.
Luego, calcule el fondo haciendo clic en más y multi medida. Copie los valores medios para pegarlos en el programa de hoja de cálculo. Luego, calcule el valor promedio.
A continuación, reste el valor promedio calculado de las pilas haciendo clic en proceso, principal y restar. Ingrese el valor obtenido y dibuje el ROI alrededor de un terminal nervioso a través de una línea poligonal antes de agregarlo al administrador de ROI. Mida la intensidad transitoria del terminal nervioso haciendo clic en más pestañas y multimedida.
A continuación, copie los valores de intensidad media y péguelos en el programa de hoja de cálculo para calcular el desplazamiento medio de las señales. Divida los valores de señal por el valor de desplazamiento promedio. Del valor obtenido, reste uno y luego multiplique por 100% seguido de trazar un gráfico transitorio de calcio para determinar la amplitud.
Después de cargar la preparación nerviosa con un tinte, la mayor parte de la sinapsis se encuentra cerca del muñón del nervio, lo que indica un nivel suficiente de fluorescencia. Después del procesamiento de la imagen, se obtuvo la transitoriedad del calcio con la resolución espacial y temporal deseada. Uno de los pasos más importantes en este protocolo es que el muñón del nervio debe colocarse en la solución que contiene el tinte en los primeros minutos después de cortar el nervio.
Este método se puede utilizar para cargar varios tintes y medicamentos en las neuronas motoras. El protocolo de registro puede ser útil para evaluar el calcio en dendritas y espinas en preparaciones del SNC. Nuestra técnica permite registrar una señal de calcio con buena resolución espacial y temporal.
El estudio de la transitoriedad del calcio es una herramienta poderosa en la regulación de la investigación de la liberación de un neurotransmisor y la plasticidad sináptica.
