Die Abschätzung eines präsynaptischen Kalziumspiegels ist eine Schlüsselaufgabe bei der Untersuchung der synaptischen Übertragung. Die Untersuchung der Kalziumsignalisierung ist auch wichtig, um Wege zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu finden. Der Hauptvorteil der vorgestellten Ladetechnik besteht darin, dass die Färbung nur für die interessierenden Zellen durchgeführt wurde.
Unsere Methode zur Erfassung der Kalziuminvergänglichkeit bietet eine extrem gute räumlich-zeitliche Auflösung. Die vorgestellte Registrierungsmethode kann für Neurophysiologen hilfreich sein, die schnelle periodische Prozesse mit einem konfokalen Mikroskop registrieren müssen. Der schwierigste Schritt in der Belastungstechnik besteht darin, den Nerv in der Pipette zu halten.
Der Durchmesser der Pipette muss perfekt passen, also machen Sie einige mehrere. Zu wissen, dass alle Schritte im Protokoll kompliziert sind und jeden von ihnen zu demonstrieren, wird sehr helfen. Fixieren Sie zunächst das Muskulaturgewebe Levator auris longus leicht gestreckt in der elastomerbeschichteten Petrischale mit den feinen Edelstahlstiften und geben Sie Ringer-Lösung in die Schale, bis der Muskel vollständig bedeckt ist.
Als nächstes verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um eine Mikropipette mit einer feinen scharfen Spitze für die intrazellulären Aufnahmen vorzubereiten. Verwenden Sie Kapillaren ohne innere Filamente. Nachdem Sie die Verjüngung mit einem Schleifmittel geritzt haben, brechen Sie die Mikropipettenspitze ab und lassen Sie eine Spitze mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern offen.
Dann feuerpolieren Sie die Spitze, bis der Innendurchmesser von 80 Mikrometern auf 12 Mikrometer schrumpft. Wenn Sie fertig sind, befestigen Sie einen Silikonschlauch auf der einen Seite und eine Spritze ohne Nadel auf der anderen Seite der Füllungspipette. Finden Sie unter einem Stereomikroskop heraus, wo sich der Nervenstamm in separate Nervenäste verwandelt.
Legen Sie die Füllpipette mit Wachs auf die Petrischale und bewegen Sie dann die Pipettenspitze, bis sie über dem Nerv steht. Schneiden Sie den Nerv in der Nähe der Muskelfaser mit einer feinen Schere ab und lassen Sie ein kleines Stück des Nervenstumpfes von etwa einem Millimeter Länge zurück. Dann saugen Sie den Nervenstumpf mit etwas Ringer-Lösung in die Spitze der Füllungspipette ab, ohne den Nerv einzuklemmen.
Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Silikonschlauch aus der Füllpipette. Verwenden Sie später eine Spritze mit einem langen Filament, um die Farbstoffladelösung zu ziehen. Führen Sie dann die Filamentspitze mit der Ladelösung in die Füllpipette ein und geben Sie die Mischung auf den Nervenstumpf ab, gefolgt von einer Inkubation der Nervenvorbereitung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
Nach der Inkubation spülen Sie das Nervenpräparat mit frischer Ringer-Lösung aus, bevor Sie es zwei Stunden lang mit 50 Milliliter Ringer-Lösung in einem Glasbecher bei 25 Grad Celsius behandeln. Für die konfokale Mikroskopie montieren Sie das Nervenpräparat in eine siliziumelastomerbeschichtete Experimentierkammer und fixieren Sie es, leicht gestreckt, mit einem Satz Stahlmikronadeln. Dann spülen Sie das Präparat ausgiebig mit der Ringer-Lösung.
Installieren Sie eine Saugelektrode auf der Kammer. Nachdem Sie die Vorbereitungskammer auf den Mikroskoptisch montiert haben, legen Sie die Einlass- und Auslassverschraubungen in die Kammer. Schalten Sie ein schwerkraftgetriebenes System ein, um die überschüssige Lösung aus der Zubereitung zu entfernen.
Wenn Sie fertig sind, stecken Sie die stimulierende Saugelektrode in einen elektrischen Stimulator und stellen Sie sicher, dass nach Reizen Muskelkontraktionen auftreten. Füllen Sie dann das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung, die 10 Mikromolare d-Tubocurarin enthält, und schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein, um die Perfusion zu starten. Wählen Sie im konfokalen Laserscanning-Mikroskop oder der LSCM-Software Elektrophysiologie und Erfassungsmodus, um Bildgebungsparameter einzustellen.
Wählen Sie in den Einstellungen des Jobmenüs die Triggereinstellungen aus, um den Stimulator mit dem Synchronisationsimpuls des Mikroskops auszulösen, und stellen Sie den Trigger auf das Rahmenfeld auf den OUT 1-Kanal ein. Drehen Sie den Scanmodus auf XYT bei einer Scanfrequenz von 1.400 Hertz. Der Zoomfaktor sollte bei vollständig geöffnetem Loch 6,1 betragen.
Stellen Sie sicher, dass der sequenzielle, transpassierende, bidirektionale X-Modus aktiviert ist, stellen Sie dann die Mindestzeit für die Bildung eines Frames auf 52 Millisekunden ein und erfassen Sie Frames in einem Rohvideo mit 20 Bildern. Stellen Sie die Anregungswellenlänge des Argonlasers auf 488 Nanometer mit 8% Ausgangsleistung ein. Wenn die Parameter eingestellt sind, drücken Sie die Live-Modus-Taste, um eine Live-Vorschau der mit dem Farbstoff beladenen Nervenenden zu erhalten.
Suchen Sie im Live-Modus nach der Region von Interesse oder ROI, um den besten Fokus zu erhalten. Verschieben Sie dann die Verzögerung des Stimulators um zwei Millisekunden weniger als der vorherige Wert und führen Sie die Datenerfassungssoftware aus, um 26 Sequenzen zu erfassen, indem Sie jede Sequenz um zwei Millisekunden von der vorherigen verschieben. Um die aufgenommenen Videos zu verarbeiten, führen Sie die Leica Application Suite X oder LAS X Software aus und öffnen Sie das erstellte Projekt.
Klicken Sie dann auf Exportieren und Speichern unter, um Frames im TIF-Format im Zielordner zu speichern. Führen Sie als Nächstes die ImageJ-Software aus und klicken Sie auf Datei, Import und Bildsequenz. Wählen Sie im geöffneten Bildsequenzfenster den Zielordner aus und öffnen Sie den ersten Frame.
Gehen Sie in den Sequenzoptionen zum Startbildfeld und legen Sie die Bildnummer für den ersten Frame auf eins fest. Legen Sie dann im Inkrementfeld den Wert fest, der der Anzahl der Bilder in der anfänglichen Signalaufzeichnung entspricht, bevor Sie auf OK klicken. Um die generierte Datei der zusammengefügten ersten Frames in einem separaten Ordner zu speichern, klicken Sie in der angegebenen Reihenfolge auf die Registerkarten Datei, Speichern und Ordner.
Wiederholen Sie die Prozeduren für 19 Bilder, indem Sie die entsprechende Bildnummer im Startbildfeld festlegen. Wenn Sie alle Bilder erhalten haben, klicken Sie auf Datei, Import und Bildsequenz, um eines in den Startbild- und Inkrementfeldern auszuwählen. Das fertige Video mit allen Bildern, die mit erhöhter zeitlicher Auflösung zusammengefügt wurden, ist zu sehen.
Speichern Sie dann die Videodatei im TIF-Format. Um das zusammengefügte Video zu analysieren, klicken Sie auf Bild, Stapel, Werkzeuge und Stapelsortierer. Gehen Sie dann zu Analyse, Tools und ROI-Manager.
Berechnen Sie dann den Hintergrund, indem Sie auf Mehr und Multi Measure klicken. Kopieren Sie Mittelwerte, um sie in das Tabellenkalkulationsprogramm einzufügen. Berechnen Sie dann den Durchschnittswert.
Als nächstes subtrahieren Sie den berechneten Durchschnittswert von den Stapeln, indem Sie auf process, main und subtrahieren klicken. Geben Sie den erhaltenen Wert ein und zeichnen Sie den ROI um ein Nerventerminal über eine Polygonlinie, bevor Sie ihn dem ROI-Manager hinzufügen. Messen Sie die vorübergehende Intensität des Nervenendes, indem Sie auf weitere und mehrere Messregisterkarten klicken.
Kopieren Sie dann die mittleren Intensitätswerte und fügen Sie sie in das Tabellenkalkulationsprogramm ein, um den durchschnittlichen Offset der Signale zu berechnen. Teilen Sie die Signalwerte durch den durchschnittlichen Offset-Wert. Subtrahieren Sie vom erhaltenen Wert eins und multiplizieren Sie dann mit 100%, gefolgt von einem Kalzium-Transientengraphen, um die Amplitude zu bestimmen.
Nach dem Laden der Nervenvorbereitung mit einem Farbstoff befindet sich der größte Teil der Synapse in der Nähe des Nervenstumpfes, was auf ein ausreichendes Maß an Fluoreszenz hinweist. Nach der Bildverarbeitung wurde die Kalziumflüchtigkeit mit der gewünschten räumlichen und zeitlichen Auflösung erreicht. Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist, dass der Nervenstumpf in den ersten Minuten nach dem Schneiden des Nervs in die farbstoffhaltige Lösung gelegt werden muss.
Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Farbstoffe und Medikamente in Motoneuronen zu laden. Das Registrierungsprotokoll kann für die Beurteilung von Kalzium in Dendriten und Stacheln in ZNS-Präparaten nützlich sein. Unsere Technik ermöglicht es, ein Kalziumsignal mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu registrieren.
Die Untersuchung der Kalziumtransivenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Forschungsregulation einer Neurotransmitterfreisetzung und synaptischen Plastizität.
