Este protocolo ayuda a aislar los endosomas de reciclaje que contienen fracción de células de mamíferos transfectadas para facilitar la investigación del tráfico de proteínas a través del tráfico endocítico. Esta técnica es fácil de manejar y aplicable tanto a muestras de tejido como de células. Demostrando el procedimiento estará la señorita Zhai Yu Qi, estudiante de doctorado del Laboratorio del Dr. Lao.
Para comenzar, placa 2 veces 10 a las 6 células en un plato de cultivo de 100 milímetros. Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cosechar las células, deseche el medio de cultivo 48 horas después de la transfección y lave las células dos veces con PBS helado.
Luego agregue un mililitro de PBS helado suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa 0.5X en un cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5X a cada plato. A continuación, utilizando un raspador de células, recoja las células y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. las celdas por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente en cinco mililitros de tampón de homogeneización. Recoger las células de nuevo por centrifugación y resuspendir el pellet celular en un mililitro de tampón de homogeneización. Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce utilizando de 15 a 20 golpes.
Luego transfiera el homogonato a un tubo de centrifugación de dos mililitros. Añadir 700 microlitros de tampón de homogeneización al homogonato. Luego gire el homogonato diluido y recoja 1,5 mililitros del sobrenadante.
Gire el sobrenadante recolectado nuevamente, luego recoja 1.4 mililitros del sobrenadante y etiquételo como sobrenadante post-nuclear. Para preparar la columna de gradiente de densidad, transfiera 1,2 mililitros del sobrenadante postnuclear a un tubo de ultracentrífuga. Luego agregue un mililitro de solución de sacarosa al 62% a la muestra y mezcle bien mediante pipeteo suave.
A continuación, agregue cuidadosamente 3,3 mililitros de solución de sacarosa al 35% sobre la muestra, seguido de 2,2 mililitros de solución de sacarosa al 25% sobre la solución de sacarosa al 35%. Finalmente, llene el tubo de la ultracentrífuga hasta la parte superior con tampón de homogeneización. Centrifugue la columna de gradiente de densidad y recoja cuidadosamente 12 fracciones de 1 mililitro cada una, comenzando desde la parte superior del gradiente.
A continuación, diluir todas las fracciones con un mililitro de tampón de dilución y centrifugar las muestras diluidas. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de muestra 1X para cosechar las fracciones. El marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se detectó en la fracción siete.
También se investigaron otros marcadores subcelulares, incluidos beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 y Lamp1. También se detectó una señal POSITIVA de EEA1 en la fracción siete. Las intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV y Rab11 tanto en la Fracción siete como en el sobrenadante postnuclear se muestran aquí.
Después de transectar células HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, no se encontraron cambios en la distribución de ELMO1 con sobreexpresión de ARF6Q67L y FE65. El nivel de ELMO1 en la fracción siete se comparó entre diferentes transfecciones y se encontró elevado después de la cotransfección de ARF6Q67L. Se observó un aumento adicional cuando tanto ARF6Q67L como FE65 fueron coexpresados.
Por el contrario, la eliminación de FE65 disminuyó el enriquecimiento de Elmo1 mediado por ARF6 en la fracción siete. La fracción obtenida podría ser utilizada para su posterior análisis. Por ejemplo, western blotting para visualizar los cambios en el nivel de proteína en la fracción.
