Bu protokol, endosit kaçakçılığı yoluyla protein kaçakçılığının araştırılmasını kolaylaştırmak için transfected memeli hücrelerinden fraksiyon içeren geri dönüşüm endozomlarının izole edilmesine yardımcı olur. Bu tekniğin kullanımı kolaydır ve hem doku hem de hücre örnekleri için geçerlidir. Prosedürü gösteren bayan Zhai Yu Qi, Dr.Lao Laboratuvarı'ndan bir doktora öğrencisi.
Başlamak için, 100 milimetrelik bir kültür çanasında 6 hücreye 2 kez 10 plakalayın. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect. Hücreleri hasat etmek için, transfection sonrası 48 saat kültür ortamını atın ve hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra her yemeğe 0,5X fosfataz inhibitörü kokteylinde 0,5X proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. sallanan kova rotor kullanarak santrifüjleme ile hücreler.
Süpernatantı atın ve hücre peletini beş mililitre homojenizasyon tamponunda hafifçe yeniden diriltin. Hücreleri santrifüjleme ile tekrar toplayın ve hücre peletini bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden biriktirin. Hücreleri 15 ila 20 vuruş kullanarak bir Dounce Homojenizatör ile homojenize edin.
Daha sonra homogonat iki mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Homogonate 700 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş homogonat döndürün ve 1,5 mililitre süpernatant toplayın.
Toplanan süpernatantı tekrar döndürün, sonra 1,4 mililitre süpernatantı toplayın ve nükleer sonrası süpernatant olarak etiketleyin. Yoğunluk gradyan sütununu hazırlamak için, nükleer sonrası süpernatantın 1,2 mililitresini ultracentrifuge tüpüne aktarın. Daha sonra numuneye bir mililitre% 62 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.
Daha sonra, numunenin üzerine 3,3 mililitre% 35 sakkaroz çözeltisi ve ardından% 35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mililitre% 25 sakkaroz çözeltisi ekleyin. Son olarak, ultracentrifuge tüpünü homojenizasyon tamponu ile doldurun. Yoğunluk gradyan sütununu santrifüjlayın ve degradenin üstünden başlayarak her biri 1 mililitrenin 12 kesirini dikkatlice toplayın.
Daha sonra, tüm fraksiyonları bir mililitre seyreltme tamponu ile seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 mikrolitre 1X numune tamponu ekleyin. Geri dönüşüm endozom işaretleyicisi Rab11, Fraksiyon 7'de tespit edildi.
Beta COP, COX IV, GAPDH, AEA1, Rab 7 ve Lamp1 dahil olmak üzere diğer hücre altı belirteçleri de araştırıldı. Kesir 7'de pozitif bir AEA1 sinyali de tespit edildi. GAPDH, Cox IV ve Rab11'in hem Fraksiyon yedi hem de nükleer sonrası üstünlükteki ölçülen bant yoğunlukları burada gösterilmiştir.
HEC293 hücrelerini ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L veya ELMO1 ARF6Q67L FE65 ile geçirdikten sonra, ARF6Q67L ve FE65 aşırı ifade ile ELMO1 dağıtımında herhangi bir değişiklik bulunamadı. Fraksiyon yedi'deki ELMO1 seviyesi farklı transfeksiyonlar arasında karşılaştırıldı ve ARF6Q67L'nin kotransfeksiyonu sonrasında yükseldiği tespit edildi. Hem ARF6Q67L hem de FE65 birlikte ifade edildiğinde daha fazla artış gözlendi.
Tersine, FE65'i nakavt etmek, Arf6 aracılı Elmo1 zenginleştirmesini Fraksiyon yedi'de azalttı. Elde edilen kesir sonraki analizler için kullanılabilir. Örneğin, fraksiyondaki protein seviyesi değişikliklerini görselleştirmek için batı şişkinliği.
