Muestreo y extracción in situ de tumores cerebrales para el análisis de metabolómica y lipidómica

Este protocolo se puede utilizar para realizar una extracción de tumores cerebrales en o junto a un servidor en el uso de fibras de microextracción de fase sólida. Esta técnica permite la extracción de moléculas pequeñas directamente de tumores resecados y proporciona una oportunidad para el diagnóstico intraoperatorio rápido mediante el acoplamiento de dispositivos de extracción directamente a la instrumentación analítica. Para preparar el dispositivo de microextracción de fase sólida, recorte la codificación de cada sonda de dispositivo de microextracción de fase sólida con recubrimientos de modo mixto o C18 a una longitud adecuada según el tamaño del tumor.

Y remoje las sondas y una solución de agua de metanol de 50 50 durante al menos una hora antes de la recolección de la muestra. Este protocolo se centra en los tumores cerebrales, pero la estrategia se puede implementar para el diagnóstico de muchos tipos de cáncer diferentes. La tecnología es totalmente portátil, por lo que no hay necesidad de ningún dispositivo adicional.

Tan pronto como sea posible después de la extirpación del tumor sumergir las fibras de la sonda con agua de grado LCMS durante cinco segundos antes de insertar las fibras en la medida de lo posible en la muestra de tejido tumoral del cerebro, para asegurarse de que toda la fase de extracción se encuentra dentro del tumor. Deje las sondas dentro del tejido durante exactamente 30 minutos para eliminar las fuentes de error debido a la presencia de artefactos de fuentes distintas del tumor de muestra, coloque las fibras de la sonda condicionadas en la mesa durante el mismo período de tiempo. Durante la extracción, etiquete los viales de HPLC que se utilizarán para el almacenamiento de la sonda después de la extracción.

Al final de la extracción, sumerja las fibras en agua de grado LCMS durante tres segundos para eliminar cualquier sangre o desechos celulares e inserte cada sonda a través de la parte inferior del septo de una sola tapa del vial hpLC para inmovilizar las fibras. A continuación, tapice los viales con las fibras inmovilizadas y coloque los viales en un recipiente de transporte adecuado. A su llegada al laboratorio, colocó inmediatamente los viales en un congelador de menos 30 o menos 80 grados centígrados durante no más de tres o cinco años, respectivamente.

Una vez que se hayan recogido todas las muestras de un solo experimento, coloque los viales que contienen las fibras de modo mixto a temperatura ambiente. y etiquetar dos viales de mililitro para la desorción coloque un inserto de vidrio en cada vial y agregue 300 microlitros de solución de agua de acetonitrilo 80 20 recién preparada a cada plaquita. Inmerso completamente la codificación de cada sonda en viales individuales del disolvente de desorción y agitar los viales durante 120 minutos a 1.200 revoluciones por minuto en un vórtice.

Una vez completada la desorción, retire las tapas de los viales y reserve 10 microlitros alícuotas de cada archivo que contenga extracto del tumor para preparar una muestra de control de calidad. A continuación, cierre los viales con nuevas tapas y coloque los viales en el muestreador automático de cuatro grados Celsius de un espectrómetro de masas de alta resolución de cromatografía líquida. Para preparar las muestras para el análisis lipidomico, coloque los viales que contienen las fibras C 18 a temperatura ambiente y etiquete dos viales de HPLC de mililitro para el lugar de interrupción insertos de vidrio silanizado en los viales y agregue 200 microlitros de 50 50 solución de metanol isopropanol recién preparada a cada inserción.

Sumerja completamente cada recubrimiento de sonda en el disolvente y agite las muestras durante 50 minutos a 1.200 revoluciones por minuto en un vórtice. Al final del tiempo, detenga la desorción retirando las tapas y luego reserve una alícuota de 10 microlitros de cada archivo que contenga extracto del tumor para preparar la muestra de control de calidad y cerrar los viales con nuevas tapas. A continuación, coloque los viales en el muestreador automático de cuatro grados Celsius del espectrómetro de masas de alta resolución de cromatografía líquida.

Se determinó que la reproducibilidad del análisis instrumental era muy buena sobre la base de la agrupación ajustada de las muestras de control de calidad en la gráfica de análisis de componentes principales. Estos datos lipidómicos de muestras recogidas de pacientes con gliomas y meningiomas ponen de relieve la capacidad de las muestras tumorales para distinguirse según su origen histológico y neoplasia maligna. Como se ilustra con estos datos metabolómicos, los gliomas se pueden dividir aún más en función de su grado de neoplasia maligna y o según la presencia o ausencia de mutaciones de interés.

El análisis estadístico también permite la selección de compuestos específicos dentro de los grupos estudiados. Es esencial controlar cuidadosamente el tiempo de extracción y mantener las condiciones reproducibles para todas las muestras. Alternativamente, las muestras se pueden disolver de la fibra directamente a la Sra. sin separación cromatográfica permitiendo el análisis específico de marcadores específicos y acortando todo el procedimiento a varios minutos.