Este protocolo modular permite explorar múltiples eventos moleculares representados por lípidos estructurales y de señalización, y / o ARN, en regiones tisulares discretas y en sangre con una mejor producción de datos cuantitativos y cualitativos por muestra de muestra. El método es aplicable a cualquier modelo experimental, y también se puede aplicar a muestras de tejido humano y sangre. Demostrando el procedimiento estarán Claudia Schwitter, técnica, Julia Post, estudiante de posgrado, y Raissa Lerner, postdoctoral en mi grupo.
Para comenzar, tome cerebros previamente aislados, enteros y congelados de ratones con epilepsia aguda y inducida por ácido kolínico tratada profilácticamente. Monte los cerebros en el sistema de montaje del criostato. Ajuste el grosor a 50 micrómetros y corte el cerebro en modo de recorte cerca de la región de interés.
Cuando se acerque a la región de interés, establezca el grosor de 18 a 20 micrómetros. Para localizar la subregión de interés, tiñe las rodajas cerebrales con azul de toluidina. Use un microscopio para inspeccionar las rodajas teñidas para identificar las regiones de interés que se perforarán, y use un atlas de ratones como referencia para encontrar las regiones anatómicas cerebrales apropiadas.
Use perforadores de muestra para tomar punzones de 0.8 a 1.0 milímetros de diámetro. Transfiera los punzones para coextracciones de endocannabinoides y eicosanoides a tubos de ámbar de 2 mililitros preenfriados con siete bolas de acero preenfriadas por tubo. Para la coextracción de fosfolípidos y endocannabinoides, la coextracción dual de lípidos y ARN, transfiera los punzones a tubos de extracción libres de RNasa de 2 mililitros con perlas de cerámica.
Pese los punzones congelados en la cámara frigorífica e inmediatamente proceda a la extracción o congele a 80 grados centígrados. Para realizar la coextracción lipídica líquido-líquido de endocannabinoides y eicosanoides a partir de piezas cerebrales, punzones o muestras de polvo de tejido, coloque los tubos de extracción que contienen las muestras de tejido y siete bolas de acero sobre hielo. Agregue 600 microlitros de MTBE helado y 50 microlitros de agua de acetonitrilo que contengan los estándares internos.
Después de agregar 400 microlitros de ácido fórmico molar 0.1, use un lisario tisular para homogeneizar durante 30 segundos a 1 minuto. Centrifugar este homogeneizado durante 15 minutos a 5.000 veces g a 4 grados centígrados. Colócalo en el congelador durante 10 minutos a 80 grados centígrados para congelar la fase inferior acuosa, lo que facilitará la transferencia de la fase orgánica superior.
Transfiera la fase orgánica superior a nuevos tubos de ámbar de 1,5 mililitros, evapore bajo una corriente suave de nitrógeno a 37 grados Celsius durante 10 minutos y luego reconstituya en 50 microlitros de agua de acetonitrilo para su posterior análisis. Almacene la fase acuosa a 20 u 80 grados Celsius para un análisis adicional del contenido de proteínas. Para coextractar endocannabinoides y eicosanoides de muestras de plasma, coloque las muestras de plasma congeladas en hielo y deje que se descongelen por completo.
Añadir 800 microlitros de MTBE y 50 microlitros de agua de acetonitrilo que contengan los estándares internos optimizados para el pico utilizando muestras de plasma de referencia. Agregue 600 microlitros de ácido fórmico molar 0.1 y vórtice a 4 grados Celsius durante 2 minutos. Centrifugar las muestras a 4.000 veces g durante 15 minutos a 4 grados centígrados.
Transfiera la fase orgánica a nuevos tubos. Evaporarlo bajo una corriente suave de nitrógeno a 37 grados Centígrados, y luego reconstituirlo con 50 microlitros de agua de acetonitrilo para el análisis de monitoreo de reacciones múltiples por cromatografía líquida. Para realizar la coextracción de fosfolípidos y endocannabinoides de regiones cerebrales, punzones u otras muestras de polvo de tejido, coloque los tubos de extracción que contienen las muestras de tejido y las cuentas de cerámica en hielo.
Añadir 800 microlitros de metil terc-butil éter y mezcla de metanol y 10 microlitros de metanol que contengan las normas internas. Luego, agregue 200 microlitros de ácido fórmico al 0.1% que contengan 25 tetrahidroliptatina micromolar / URB597 y 50 microgramos por mililitro de BHT. Después de homogeneizar con un homogeneizador de tejido, centrífuga a 5, 000 veces g y 4 grados Celsius durante 15 minutos.
Transfiera la fase orgánica superior a nuevos tubos, evapore bajo una corriente suave de nitrógeno a 37 grados Celsius y luego reconstituya este extracto de lípidos con 90 microlitros de metanol. Si procede inmediatamente, agregue 10% de agua a una alícuota de extracto de lípidos e inyecte 10 microlitros en el LC / MS para el análisis de fosfolípidos. Para un análisis endocannabinoide adicional, continúe con el siguiente paso.
Tome una alícuota del extracto de lípidos, evapore hasta la sequedad y reconstituya en agua de acetonitrilo. Para realizar la extracción dual de ARN y lípidos y la coextracción de fosfolípidos y endocannabinoides de muestras de tejido, descongelar alícuotas de polvo de tejido o racimos cerebrales a 4 grados centígrados. Agregue el tejido a los tubos de extracción con cuentas de cerámica.
Luego agregue 600 microlitros de tampón RLT junto con 200 microlitros de cloroformo. Para la coextracción de fosfolípidos y endocannabinoides, espe las muestras con 10 microlitros de mezcla estándar interna y homogeneizar a alta velocidad durante 20 segundos. Transfiera muestras homogeneizadas a nuevos tubos de centrífuga y centrífuga durante cinco minutos a toda velocidad y 4 grados centígrados para permitir la separación de fases.
Transfiera la fase superior a un tubo fresco para la extracción de ARN utilizando un kit estándar. Elute extrajo ARN en un volumen total de 50 microlitros de agua libre de RNasa y lo almacenó a 80 grados centígrados. Para la extracción de lípidos, agregue 800 microlitros de MTBE/metanol y 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1% a la fase inferior que contiene cloroformo.
Vórtice durante 45 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera la fase orgánica superior a un nuevo tubo. Evaporarlo bajo una suave corriente de nitrógeno a 37 grados centígrados.
Para un análisis adicional de LC/MS, reconstituya la muestra en 90 microlitros de metanol y guárdela a 20 u 80 grados centígrados, o proceda inmediatamente al análisis. Para un análisis endocannabinoide adicional, continúe con el siguiente paso. Tome una alícuota del extracto de lípidos, evapore hasta la sequedad y reconstituya en agua de acetonitrilo.
Luego, inyecte 20 microlitros en el LC / MS para el análisis endocannabinoide. La inducción con ácido kínico de las convulsiones epilépticas agudas condujo a una intensidad máxima de las convulsiones una hora después de la inyección. El perfil lipidómico de endocannabinoides y eicosanoides, así como fosfolípidos y endocannabinoides, muestra cambios en el nivel de lípidos en la corteza cerebral, el cuerpo estriado, la región talámica, el hipocampo, el hipotálamo, el cerebelo, así como el corazón y el tejido pulmonar en ratones epilépticos inducidos por ácido kínico y controles.
Después de la extracción dual de fosfolípidos y endocannabinoides y ARN para el perfil cuantitativo de los golpes cerebrales de ratón, se analizó la distribución cuantitativa de lípidos en el hipotálamo, la amígdala basolateral y el hipocampo ventral y dorsal. Niveles de expresión relativos de enzimas endógenas y receptores implicados en la señalización lipídica, así como marcadores de actividad cerebral investigados a nivel de ARNm en diferentes regiones y subregiones cerebrales de ratones sometidos a crisis epilépticas inducidas por ácido kínico y controles. La epilepsia inducida por ácido kínico causó una pérdida masiva de la señal neunética, predominantemente en la región CA1, CA3 e hilus del hipocampo, acompañada de eventos apoptóticos indicados por la señal de caspasa-3 en comparación con los ratones inyectados con solución salina de control.
Después del tratamiento con palmitoiletanolamida subcrónica, la señal de proteína de los núcleos neuronales se conservó notablemente y la señal CASP3 apenas fue detectable. El golpe cerebral y la disección de áreas cerebrales discretas son bastante desafiantes y requieren habilidades finas para obtener un muestreo consistente en múltiples cohortes. Por lo tanto, la práctica en órganos de prueba y un buen conocimiento de la morfología cerebral son muy recomendables.
