Debido a que este método determina las células unidas a anticuerpos que bloquean la DP-1 utilizando sangre periférica de los pacientes, se puede identificar el subconjunto específico responsable de los efectos antitumorales y los eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario. Este método sólo necesita una pequeña cantidad de muestra de sangre y el proceso de análisis es bastante simple y rápido. Sólo necesita una máquina de citometría de flujo.
Para comenzar, recoja muestras de sangre entera en tubos de recolección de sangre que contengan EDTA. Tratar cada tubo de citometría de flujo de poliestireno redondo de cinco mililitros con un mililitro de suero bovino 2% fetal en PBS. Vórtice durante 10 segundos.
A continuación, transfiera 20 microlitros de muestras de sangre entera a los tubos inferiores redondos de cinco mililitros tratados. Añadir 20 microlitros de 2%FBS en PBS y 10 microlitros de reactivo de bloqueo de receptores FC específicos para humanos. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lyis de glóbulos rojos. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir cuatro mililitros de 2%FBS en PBS y girar las células hacia abajo a 400 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.
Retire el sobrenadante por aspiración. Repita el proceso de lavado y aspiración. Resuspender las células en 100 microlitros de 2%FBS en PBS y dividir en dos tubos de 50 microlitros cada uno.
Agregue anticuerpos marcadores de superficie. Mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las muestras dos veces en 2%FBS en PBS como anteriormente.
Resuspender las células en 200 microlitros de 2%FBS en PBS. Inserte los tubos en el citometro de flujo y adquiera las células siguiendo el protocolo recomendado. Registre 10.000 eventos como la puerta de linfocitos y exporte datos de flujo como archivos FCS para su análisis.
Abra archivos en el software de análisis y haga clic en el archivo de control de isotipo para visualizar las celdas en una dispersión hacia delante frente frente a la gráfica de dispersión lateral y linfocitos de puerta. Seleccione celdas individuales utilizando FSCH frente a FSCW y SSCH frente a SSCW y muésquelas en una gráfica CD3 frente a CD8 o CD3 frente a CD4. Ate la puerta de las células T CD8 y las células T CD4 respectivamente.
Seleccione las celdas cerradas y muésquelas en una gráfica PD-1 frente a IgG4 humana. Y luego, en función del control de isotipos, seleccione Q3 para identificar las células T8 y CD4 enlazadas a anticuerpos de bloqueo de PD-1. En este estudio, la estrategia de gating y el análisis de citometría de flujo detectaron la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a las células T obtenidas de una gota de sangre periférica del paciente.
La gráfica PD-1 frente a IgG4 humana muestra el estado de unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en las células T. Los puntos naranjas y los puntos negros indican la tinción de anticuerpos y isotipos anti-IgG4 respectivamente. Antes de administrar el anticuerpo de bloqueo de PD-1, no había células T CD8 o CD4 positivas IgG4 humanas y se confirmó la expresión de PD-1 mediante un anticuerpo de detección de PD-1.
Después de la administración de nivolumab o pembrolizumab, IgG4 puede detectarse en células T mediante anticuerpos anti-IgG4, mientras que el PD-1 que detecta anticuerpos EH12.1 no reconoce ningún PD-1 en las células T. Las puertas rojas, azules y verdes indican la unión completa, la unión parcial y la pérdida de enlace respectivamente. Después de que los pacientes interrumpieron nivolumab y pembrolizumab, el estado de la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a células T CD8 disminuyó.
Hubo un enlace parcial y finalmente la pérdida completa de enlace. Por favor, asegúrese de mezclar la muestra de sangre con la lelisis RBC también. Además, mezclar la lysis RBC antes de la tinción del marcador de superficie es el paso clave en este método.
Si el investigador tiene acceso a una máquina avanzada de citometría de flujo, las células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo de PD-1 se pueden evaluar con más y más marcadores relacionados con esta estrategia se puede aplicar para perfilar fenotipos de células T responsables de eventos adversos causados por anticuerpos de bloqueo de PD-1. El muestreo de pacientes con eventos adversos desarrollados es importante para evaluar la utilidad de esta estrategia.
