لأن هذه الطريقة تحدد الخلايا المضادة للأجسام المضادة التي تمنع PD-1 باستخدام الدم المحيطي من المرضى، يمكن تحديد المجموعة الفرعية المحددة المسؤولة عن تأثيرات مضادات الوفاة والأحداث الضائرة المرتبطة بالمناعة. هذه الطريقة تحتاج فقط كمية صغيرة من عينة الدم وعملية التحليل بسيطة إلى حد ما وسريعة. انها تحتاج فقط إلى آلة تدفق القياسات.
للبدء، جمع عينات الدم الكامل في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على EDTA. علاج كل خمسة ملليلتر جولة أسفل البوليسترين تدفق أنبوب الخلايا مع ملليلتر واحد من مصل الأبقار الجنين 2٪ في برنامج تلفزيوني. دوامة لمدة 10 ثوان.
ثم نقل 20 ميكرولترات من عينات الدم كله إلى معالجة خمسة ملليلتر أنابيب القاع الجولة. إضافة 20 microliters من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني و 10 ميكرولترات من مستقبلات FC محددة الإنسان منع الكاشف. اخلطي جيداً وينبيها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من خلايا الدم الحمراء العازلة. اخلطي جيداً وينكضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة أربعة ملليلترات من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني وتدور أسفل الخلايا في 400 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
إزالة المناط من الطموح. كرر عملية الغسيل والتطلع. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولترات من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني وتقسيمها إلى أنبوبين من 50 ميكرولترات لكل منهما.
إضافة الأجسام المضادة لعلامة السطح. اخلطي جيداً وينكضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل العينات مرتين في 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني كما كان سابقا.
Resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني. أدخل الأنابيب في عداد الخلايا المتدفقة والحصول على الخلايا باتباع البروتوكول الموصى به. سجل 10، 000 الأحداث وبوابات الخلايا الليمفاوية وتدفق البيانات التصدير كملفات FCS للتحليل.
فتح الملفات في برنامج التحليل وانقر على ملف عنصر تحكم isotype لتصور الخلايا على مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر وبوابات الخلايا الليمفاوية. حدد خلايا مفردة باستخدام FSCH مقابل FSCW و SSCH مقابل SSCW وعرضها على CD3 مقابل CD8 أو CD3 مقابل رسم CD4. بوابة CD8 T-الخلايا وCD4 الخلايا التائية على التوالي.
حدد الخلايا المسور وعرضها على مخطط PD-1 مقابل IgG4 الإنسان. ثم استناداً إلى التحكم isotype، حدد Q3 لتحديد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة CD8 وCD4 الخلايا T-الخلايا. في هذه الدراسة، كشفت استراتيجية الغاء وتحليل تدفق قياس الخلايا PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة للخلايا التائية التي تم الحصول عليها من قطرة دم المحيطية المريض.
يُظهر مخطط PD-1 مقابل IgG4 البشري حالة الربط للأجسام المضادة المانعة لـ PD-1 على الخلايا التائية. تشير النقاط البرتقالية والنقاط السوداء إلى الأجسام المضادة IgG4 وتلوين التحكم في الأيزو نوع على التوالي. قبل أن تدار PD-1-حظر الأجسام المضادة, لم IgG4 الإنسان إيجابية CD8 أو CD4 الخلايا T-الخلايا كانت موجودة وتم تأكيد التعبير PD-1 من قبل جهاز مكافحة الأجسام المضادة الكشف PD-1.
بعد nivolumab أو pembrolizumab الإدارة، يمكن الكشف عن IgG4 على الخلايا التائية من قبل المضادة IgG4 المضادة في حين أن PD-1 الكشف عن الأجسام المضادة EH12.1 لا تعترف أي PD-1 على الخلايا التائية. تشير البوابات الحمراء والزرقاء والأخضر إلى الربط الكامل والربط الجزئي وفقدان الربط على التوالي. بعد توقف المرضى nivolumab وpembrolizumab، انخفضت حالة الجسم المضاد PD-1 حظر ملزمة لCD8 الخلايا التائية.
كان هناك ربط جزئي وأخيراً فقدان كامل للربط. يرجى التأكد من خلط عينة الدم مع تحلل RBC كذلك. أيضا، خلط تحلل RBC قبل تلطيخ علامة السطح هو الخطوة الرئيسية في هذه الطريقة.
إذا كان الباحث لديه إمكانية الوصول إلى آلة متقدمة تدفق الخلايا الخلوية، PD-1 حظر الأجسام المضادة ملزمة الخلايا تي يمكن تقييمها مع علامات أكثر وأكثر ذات الصلة بهذه الاستراتيجية يمكن تطبيقها لتحديد الأنماط الظاهرية T-الخلية المسؤولة عن الأحداث السلبية الناجمة عن الأجسام المضادة PD-1-حظر. أخذ العينات من المرضى الذين يعانون من الأحداث السلبية المتقدمة مهم لتقييم فائدة هذه الاستراتيجية.
