Hemos desarrollado un protocolo definido, reproducible y de larga data para la secuenciación de ARN pequeño y para analizar lecturas normalizadas utilizando herramientas bioinformáticas de código abierto. Las principales ventajas de nuestra estrategia son que recoge con precisión los microRNAs a través de la purificación de gel y que el análisis bioinformático se puede aplicar independientemente de cómo se recojan los microRNAs. La secuenciación de alto rendimiento de los microRNAs puede revelar información sobre los mecanismos de la enfermedad, el procesamiento de microRNA y la cuantificación precisa de los enfoques de terapia génica que proporcionan ARN pequeños.
Asegúrese de trabajar en un entorno libre de RNase y de mantener todos los productos de ARN en hielo durante todo el procedimiento. La visualización de los pasos de corte de gel ayudará a los espectadores a identificar el tamaño correcto de los productos necesarios para aplicaciones posteriores. Para tres ranurados de adaptadores primos, combine 11 microlitros de ARN con 1,5 microlitros de tampón de reacción ligasa 10X T4RNA libre de ATP, un microlitros de polietilenglicol y 0,5 microlitros de tres enlacedores primos.
Calienta las muestras a 95 grados centígrados en un termociclador durante 30 a 40 segundos, seguido de enfriar sobre hielo durante un minuto. Añadir un microlitro de T4RNA ligasa dos e incubar la reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras las muestras están incubando, vierta un gel de poliacyrilamida al 15% entre placas de vidrio separadas de 0,8 milímetros en un molde de plástico e inserte un peine.
Cuando el gel se haya solidificado, añadir 0,5 5X TBE al tanque y pipeta vigorosamente para lavar los pozos de urea residual. Después de pre-ejecutar el gel de poliacrilamida durante 25 minutos a 375 voltios, cargue las muestras dejando al menos un carril entre cada muestra. Cargue 20 microlitros de al menos dos conjuntos de marcadores en un patrón asimétrico para realizar un seguimiento de la orientación del gel y ejecutar el gel a una constante de 375 voltios.
Después de 15 minutos, aumentar a una constante 425 voltios para el resto de la carrera y ejecutar el gel durante unas dos horas. Al final de la carrera, utilice un separador de placas para retirar el gel de las placas de vidrio y coloque el gel en un protector de página de plástico. Diluir cinco microlitros de bromuro de etidio en 500 microlitros de agua destilada y añadir el tinte a los carriles de marcador justo por encima del marcador azul claro superior.
A continuación, utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar los geles del marcador superior a inferior en cada carril bajo la luz ultravioleta y transferir las piezas a un cuadrado de cuatro por cuatro centímetros de película de sellado de laboratorio. Cortar el gel con unos tres cortes horizontalmente y dos cortes verticalmente para producir 12 cuadrados pequeños. Agregue 400 microlitros de cloruro de sodio molar 0,3 a la película de sellado y guíe las piezas de gel en tubos siliconizados de 1,5 mililitros.
Agitar las muestras en un nutator a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera 400 microlitros de cada sobrenadante a nuevos tubos. Añadir un mililitro de 100%etanol y un microlitro de 15 miligramos por mililitro de glucógeno co precipitante por tubo.
A continuación, guarde los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora. Para cinco ligaduras de enlaces primos, primero gire hacia abajo las muestras descongeladas y resuspendir los pellets en agua. A continuación, agregue 0,5 microlitros de 100 micromolar cinco enlacedores primos, un microlitro de tampón de ligasa T4RNA, un microlitro de 10 ATP mililolar y un microlitro de polietilenglicol a cada muestra.
Calienta las reacciones a 90 grados centígrados durante 30 segundos antes de colocarlas sobre hielo. A continuación, agregue un microlitros de T4RNA ligase uno a cada tubo e incubar las reacciones a temperatura ambiente durante dos horas. Para la transcripción inversa, recoger las muestras por centrifugación y resuspender el pellet seco al aire en 8.25 microlitros de agua libre de nucleasa.
Añadir 0,5 microlitros de imprimación de transcriptasa inversa de 100 micromolares y cinco microlitros de mezcla de reacción de transcriptasa inversa 2X de un kit complementario de síntesis de ADN. Después de tres minutos a 42 grados Celsius, agregue 1,5 microlitros de enzima transcriptasa inversa 10X a cada muestra para una incubación de 30 minutos a 42 grados centígrados en un termociclador. Después de la neutralización, preparar una reacción PCR con 29,5 microlitros de agua, cinco microlitros de tampón de taq 10X, un microlitro de trifosfato de nucleósido, dos microlitros de 25 micromolares delanteros, dos microlitros de 25 micromolares de ADN inverso, 0,5 microlitros de taq polimerasa, y 10 microlitros de la mutua transcrita inversa.
A continuación, ejecute dos reacciones PCR. Para la purificación del gel de agarosa, prepare un gel de 4% de agarosa con agarosa de baja fusión y cargue 40 microlitros o más del producto PCR en el gel con tinte de carga y 100 marcadores de tamaño de par base y 25. Después de ejecutar el gel, corte la banda por encima de la banda del par base 125 y utilice un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Agitar para disolver la banda de gel en el tampón a temperatura ambiente antes de utilizar el equipo adecuado para cuantificar la biblioteca de secuencia final. A continuación, utilice las herramientas bioinformáticas de código abierto adecuadas para analizar los datos de secuencia. En esta reacción pcR representativa en gel de agarosa de bajo derretimiento, se puede observar la adquisición del producto clonado correcto en comparación con el producto de vinculador de vinculador obtenido y muestras insaturadas frente a saturadas.
Después de la alineación con las horquillas de microARN humano, se puede observar una fuerte concordancia entre los recuentos de lectura de microARN en cada réplica. Se detectaron un total de 306 especies de microARN con el mayor número de lecturas cartografías a microRNA 122. Es importante recordar cortar los geles en el tamaño adecuado para permitir una recuperación precisa de los microRNAs.
Después de secuenciar los microRNAs, los usuarios pueden aplicar un análisis bioinformático para caracterizar la distribución de microARN dentro de sus tejidos de interés. Esta técnica se ha utilizado para identificar cómo se procesan los microARN y qué conjuntos de microARN se alteran en ciertos tipos de cáncer. Asegúrese de tener cuidado al manipular el bromuro de etidio y al mirar los geles bajo la luz ultravioleta.
