Este método es útil para analizar el papel de algunas moléculas en la guía axonal y la migración neuronal durante el desarrollo del sistema neurológico. La principal ventaja de esta técnica es que el análisis de los resultados es rápido y sencillo y no requiere un software complejo que implicaría mucha formación para los investigadores. Demostrando el procedimiento estará Mirian Segura-Feliu, un técnico de nuestro laboratorio y yo.
Para comenzar la placa 200,000 COS-1 células en platos Petri de 35 milímetros e incubar con medio de cultivo completo en una incubadora de cultivo celular con el fin de leer 70 a 80% de confluencia durante la noche. Al día siguiente, transfectar células COS-1 con el ADN codificando la molécula candidata utilizando el método de transfección basado en liposomas. Primero mezcle 250 microlitros de medio libre de suero y ADN de uno a 2 microgramos en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Para preparar un tubo liposomal, añadir 240 microlitros del medio libre de suero y 10 microlitros de reactivo de transfección liposomal, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, añadir el contenido del tubo de ADN al tubo lipsomal. Mezclar e incubar suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Sustituya el medio de las células cultivadas por 1,5 mililitros del medio libre de suero. Agregue la mezcla de liposomas de ADN lentamente y deje caer sabiamente a las células. Incubar en la incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono durante tres horas.
Después de la incubación completa, sustituya el medio por el medio de cultivo completo e incubar durante la noche en la incubadora. Al día siguiente, enjuague las células con PBS de 0,1 molares de Dulbecco. Añadir 800 microlitros de trippsina EDTA por cada plato e incubar durante cinco a 15 minutos en la incubadora de dióxido de carbono.
Recoger células separadas con dos mililitros de medio de cultivo completo en un tubo centrífugo de 15 mililitros y añadir 10 mililitros del mismo medio. Centrifugar las células a cuatro grados centígrados a 130 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y conserve el pellet que contiene células COS-1 sobre hielo.
Después de preparar la mezcla de trabajo de colágeno, agregue de 100 a 150 microlitros de la mezcla de colágeno al pellet de las células trans infectadas y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esparce de 45 a 50 microlitros de la mezcla de pellets de células de colágeno en un plato de Petri de 35 milímetros para formar una banda uniforme de células de colágeno, de aproximadamente uno a 1,5 centímetros de largo. Coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se observe la geleración.
Preparar una segunda tira que contenga células de control en un segundo plato de cultivo y colocarla en la incubadora. Cuando se complete la geleración, añada de tres a cuatro mililitros de medio de cultivo completo COS-1 calentado de 37 grados centígrados a cada plato que contenga las tiras de células de colágeno gelificadas y colóquelas en la incubadora. Utilice un bisturí fino o un helicóptero de tejido para cortar las tiras celulares de colágeno para generar piezas cuadradas pequeñas, de 400 a 500 micrómetros de longitud.
Transfiera todas las secciones de la misma condición de transfección a un plato de Petri que contenga de tres a 3,5 mililitros de medios de cultivo neuronal. Compruebe bajo un microscopio de disección la calidad de las piezas y coloque los platos en la incubadora. Use tijeras para cortar cuernos embrionarios en el día embrionario 16.5 de la cavidad abdominal de una rata hembra embarazada sacrificada y colóquelos en un plato grande de Petri que contenga un tampón frío de HBSSg.
Coloque el plato en la capucha de flujo laminar y use fórceps rectos para extraer los embriones y colóquelos en un nuevo plato que contenga HBBSg frío. Con pequeños fórceps, retire la piel, y luego con fórceps curvos y rectos, diseccione cuidadosamente el cerebro y colóquelo en un plato que contenga HBSSg frío. Bajo un microscopio diseccionando, usando un bisturí o tijeras finas, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la línea media para separar ambos hemisferios.
Luego, retire el diencéfalo y con fórceps finos, retire las meninges y los vasos sanguíneos de las piezas cerebrales. Utilice 100%etanol para limpiar todas las partes del helicóptero de tejido, especialmente la placa de corte de PTFE y la cuchilla de afeitar, y mantenga el helicóptero de tejido en la capucha de flujo laminar bajo iluminación UV durante 15 minutos. Transfiera cada pieza de tejido a la placa de corte del helicóptero de tejido.
Después de cortar el tejido, transfiera las piezas de los platos Petri de 35 milímetros llenos de tres a cuatro mililitros de NCM completo. Usando agujas finas de tungsteno, termine la disección de tejido en NCM completo. Compruebe la calidad de las rebanadas obtenidas bajo el microscopio de disección, asegurándose de que las capas son claramente identificables en la óptica de campo oscuro y disecciona la región de interés con agujas de tungsteno.
Conservar las piezas de buena calidad en un medio NCM completo en la incubadora de dióxido de carbono. La demostración visual es fundamental en los pasos relacionados con la preparación de las co-culturas que facilita las palabras para entender el proceso. Coloque varias placas estériles de cultivo de cuatro pozos en la campana de flujo laminar y prepare una mezcla de trabajo de colágeno como anteriormente.
Añadir de 15 a 20 microlitros de la mezcla de hidrogel en la parte inferior de cada pozo para producir una base circular de colágeno. Coloque los platos en la incubadora hasta que se observe la geleración completa. Y comprobar la calidad del colágeno gelizado.
Con una pipeta, transfiera un pequeño trozo de agregado de celda COS-1 a la base del hidrogel, luego use una pipeta para colocar una pieza de tejido en la misma base, cerca de la pieza de las células agregadas a una distancia de un tamaño de explant. Después de preparar una nueva mezcla de colágeno en hielo, pipetee suavemente 15 a 20 microlitros de esta nueva mezcla para cubrir el explant y el agregado celular, haciendo un sándwich como el cultivo de hidrogel. Utilice una aguja de tungsteno fino para reorientar el explant para que se enfrente al agregado celular en 500 a 600 micrómetros.
Devolver la placa a la incubadora hasta que se observe la gelificación y luego añadir 0,5 mililitros de NCM completo complementado con 2%B27 suplemento y mantener los cultivos durante 36 a 48 horas en la incubadora. Cuando los axones hipocampales se enfrentaron con Netrin-1, crecieron preferentemente hacia la fuente de Netrin-1, lo que indica que Netrin-1 actúa como una molécula quimio atractiva para estos axones. En la condición de control, o transfección simulada, todos los axones crecieron radialmente, sin ninguna preferencia direccional.
Cuando los axones del hipocampo se confrontaron con las células secretoras de Sema3E, la mayoría de ellos crecieron opuestos al agregado celular, lo que indica que Sema3E actúa como una molécula quimio repulsiva para estos axones. Esta representación esquemática del método de respuesta y cuantificación axonal muestra que en condiciones de control, los axones se distribuyeron equitativamente en cuadrantes proximales y distales, mostrados con crecimiento radial. Esto indicaba una relación distal o PD proximal de uno.
Cuando los explantes mostraron un mayor número de axones en el cuadrante proximal en comparación con el distal, lo que indica que la atracción de quimio, la proporción de DP fue mayor que una. Cuando el número de axones era mayor en el cuadrante distal que en el proximal, lo que indica la repulsión de quimio, la relación de DP era menor que una. Siguiendo este método, los investigadores pueden obtener información esencial sobre el papel de algunas moléculas durante el desarrollo neuronal, lo que nos permite establecer un punto de partida para explorar más a fondo las funciones.
Aunque esta técnica es útil en el desarrollo neuronal como esto, también podría aplicarse en el cribado farmacológico, angiogénesis, e ingeniería de tejidos como estrategias.
