Nuestro método nos permite visualizar moléculas individuales con un área de imagen 40 veces mayor que los métodos convencionales, y tiene una señal de fondo muy reducida. A diferencia de otras técnicas, nuestro enfoque utiliza una sola lente objetivo, no requiere una cámara de muestra especial, y es fácilmente compatible con los sistemas de microscopio comercial. Después de reunir los componentes necesarios, comience a construir el sistema.
Aquí, varios elementos ya están en posición en el banco. Montado en un bloque de aluminio es un cuerpo de microscopio con una etapa Piezo y soporte de muestra. También en el banco hay tres láseres y elementos ópticos para combinar los haces.
Los haces combinados se acoplan a una fibra de modo único de la forma más eficiente posible. Como último paso preliminar, ensamble una fuente de luz colimada en un sistema de jaula. Esto tiene una fuente de luz coherente temporal conectada a una fibra de modo único, un adaptador de fibra, lente acromática e iris.
Comience a trabajar con la ruta de detección. En primer lugar, coloque la fuente de luz colimada en el puerto objetivo del cuerpo del microscopio. Ajuste el espejo debajo de los objetivos para que la viga de salida sea aproximadamente horizontal y alineada con los orificios del banco.
Inserte un espejo dicroico en la trayectoria de la viga y refleje la viga 90 grados. Añada espejos para permitir el ajuste de la trayectoria del haz transmitido a una cámara sCMOS. Utilice los espejos para asegurarse de que la viga golpea el centro de la viruta.
A continuación, inserte una lente de tubo de longitud focal de 300 mililitros sobre una distancia focal de la cámara. Retire la fuente de luz colimada del cuerpo del microscopio. A continuación, ajuste la posición de la lente del tubo para ajustar su plano focal.
Detenga los ajustes cuando la cámara resuelva claramente el patrón en el techo. La ruta de detección se representa en este esquema. Tenga en cuenta la adición de un filtro de paso multibanda antes de la lente del tubo para imágenes de fluorescencia multicolor.
Regrese al cuerpo del microscopio. Allí, vuelva a instalar la fuente de luz colimada en el soporte del objetivo. Después del espejo dicroico, coloque un espejo plegable en la trayectoria de la viga reflejada para redirigirlo 90 grados.
Retire la fuente de luz colimada del cuerpo del microscopio y colóquela cerca. A continuación, inserte una lente de distancia focal de 400 milímetros a aproximadamente una distancia focal desde el espejo. En el cuerpo del microscopio instale la lente objetivo.
A continuación, ajuste la posición del espejo a lo largo del eje óptico. Observe el techo por encima del objetivo y deténgase cuando se forme un patrón de disco Airy perfecto allí. Ahora quite el objetivo y vuelva a instalar la fuente de luz colimada con un iris abierto.
Determine dónde a lo largo de la trayectoria de la viga la viga es más pequeña a unos 400 milímetros de distancia del espejo. Una vez identificado el punto, monte un espejo allí, un plano de imagen conjugado. El estado de la configuración en este punto aparece en este esquema.
El espejo que acaba de añadir está etiquetado como M5. Inserte otro espejo para reflejar el haz 90 grados y monte una lente de longitud focal de 150 milímetros más allá de ella. La lente debe estar a 150 milímetros del plano de imagen conjugado. A continuación, quite temporalmente la primera lente en la trayectoria del haz de excitación.
Con esta configuración encontrar la posición focal de la segunda lente. Coloque un espejo galvo de eje único en este punto focal como un plano focal posterior conjugado. Suministre cero voltios al espejo galvo y gire su soporte para que refleje la viga 90 grados.
A continuación, a lo largo de la trayectoria de la viga, coloque un espejo plegable que refleje la viga a 90 grados. Coloque la lente 100 milímetros a lo largo de la trayectoria del haz desde el plano focal posterior conjugado. Una vez más, retire la fuente de luz colimada del soporte del microscopio.
Añade otra lente de colimación de 100 milímetros con un adaptador de fibra y fibra de modo único junto con un iris. A continuación, utilice el iris, la fibra y la lente para enviar un haz colimado a través del sistema de imágenes. A continuación, inserte una lente cilíndrica de longitud focal 400 milímetros justo antes de la última lente de colimación en la trayectoria del haz.
Utilícelo para enfocar la viga. Inserte una lente cilíndrica de 50 milímetros 450 milímetros delante de la primera. Esta es una representación esquemática de la configuración final con las rutas de detección y excitación.
La salida de los tres láseres se acopla en el camino por la fibra de modo único. Para las pruebas preparar una muestra de hidrogel 3D. Este se compone de cuentas carmesí de 20 nanómetros mezclados con hidrogel.
En la configuración coloque la muestra de hidrogel en el portacuchillas. Para la excitación de la muestra, encienda el láser de 638 nanómetros y ajuste su potencia a menos de un milivatio. Configure el software de control de la cámara en modo de disparo interno y capture vídeo.
En este punto, el motor galvo tiene cero voltios aplicados. Coloque la cámara de modo que la imagen esté en el centro de la lente. A continuación, ajuste el espejo que es el plano de imagen conjugado.
Gire la perilla horizontal en el espejo para lograr una iluminación altamente inclinada. Grabe la imagen de la baldosa como en la imagen de fluorescencia de muestra de hidrogel 3D con perlas de 20 nanómetros. La barra de escala es de 20 micrómetros.
Continúe después de configurar el hardware y el software para barrer el espejo galvo. Este es el software de barrido de espejo galvo para la configuración. Haga arreglos para imágenes de campo de visión completa estableciendo Vmin en menos 500 milivoltios.
A continuación, establezca Vmax en 500 milivoltios. A continuación, cambie al software de adquisición de la cámara. En el modo de disparo, seleccione Externo.
En el menú desplegable LightScan PLUS, seleccione Abajo siguiente, haga clic en Control de velocidad de digital. Ahora se pueden establecer ciertos parámetros de control. En Altura de ventana, escriba 180 filas.
En Exposición, introduzca 28 milisegundos. Cuando haya terminado, vuelva al software de control de espejo. En el interruptor de software de control de espejo en pilas 3D ON. Especifique el número de pilas y el tamaño del paso.
Haga clic en tomar vídeo para iniciar la grabación de imágenes. Este es un ejemplo de imágenes epi de ADN etiquetado de una sola cadena. Por el contrario, la técnica de baldosa barrida altamente inclinada produjo esta imagen.
La imagen HIST muestra menos fondo en comparación con la imagen Epi. El ADN está en un hidrogel 3D, y la longitud de onda de excitación es de 638 nanómetros. Aquí hay una imagen Epi de la traducción eucariota etiquetada factor de alargamiento 2.
La imagen HIST ha mejorado la relación señal-fondo. También tiene una iluminación más uniforme. Ambos tienen la misma potencia de iluminación de 7,5 milivatios.
Las velocidades de imagen eran de 2,5 fotogramas por segundo. Es importante mantener constantemente un ángulo de inclinación alto y sincronizar el espejo de barrido con la lectura de la cámara. Esto garantiza una alta relación señal-fondo durante la adquisición de imágenes.
Esperamos que la microscopía HIST beneficie a varias aplicaciones, incluidas imágenes de superrescidad a profundidades de imagen más profundas y perfiles de expresión génica de alto rendimiento en sectores de tejido grueso.
