构建用于扩展视场单分子成像的高倾角扫描磁贴显微镜的指南

我们的方法允许我们可视化比传统方法大 40 倍的图像面积的单分子，并且具有大大减少的背景信号。与其他技术不同，我们的方法使用单个客观透镜，不需要特殊的样品室，并且它很容易与商业显微镜系统兼容。收集必要的组件后，开始构建系统。

在这里，几个元素已经到位的板凳上。安装在铝块上的显微镜体具有压电级和样品架。长凳上还有三个激光和光学元件来组合光束。

组合光束尽可能高效地耦合到单模光纤中。作为最后的初步步骤，在笼系统中组装一个准直光源。这具有连接到单模式光纤、光纤适配器、无色透镜和虹膜的临时相干光源。

开始使用检测路径。首先，将准直光源置于显微镜体的目标端口中。调整目标下方的镜面，使输出光束大致水平，并与工作台的孔对齐。

在光束路径中插入一面二色镜，并将光束反射 90 度。添加反射镜，以调整传输光束到 sCMOS 摄像机的路径。使用后视镜确保光束击中芯片中心。

接下来，插入一个300毫升焦距管镜头，从相机的焦距。从显微镜体上取下准直光源。然后调整管透镜的位置，以设置其焦平面。

当摄像机清楚地解析天花板上的图案时，停止调整。此示意图中描述了检测路径。请注意，在管透镜之前添加多波段通滤波器，用于多色荧光成像。

返回显微镜体。在那里，重新安装目标支架中的准直光源。在二色镜之后，在反射光束的路径中放置一个折叠镜，将其重定向 90 度。

从显微镜体上取下准直光源并将其放在附近。接下来，插入一个400毫米焦距镜头，从镜子的焦距左右。在显微镜体上安装客观透镜。

然后沿光轴调整镜面的位置。观察目标上方的天花板，并在目标形成完美的 Airy 磁盘模式时停止。现在，移除目标，用打开的光圈重新安装准直光源。

确定光束沿光束路径的最小位，在远离镜子约 400 毫米的地方。一旦确定点，在那里安装一个镜像，一个结合的图像平面。此时设置的状态将显示在此示意图中。

刚刚添加的镜像标记为 M5。插入另一面镜子，将光束反射 90 度，并在光束外安装 150 毫米焦距镜头。镜头应与偶体图像平面 150 毫米。接下来，暂时带走激发光束路径中的第一个镜头。

通过此配置，找到第二个镜头的焦距位置。在此焦点处放置一个单轴 galvo 镜像，作为结合的后焦平面。向 galvo 反射镜提供零伏特，并旋转其支架，以便其反射光束 90 度。

接下来沿着光束路径放置一个折叠镜，以 90 度反射光束。将镜头沿光束路径放置 100 毫米，从结合的后焦平面。再次，从显微镜支架上取下准直光源。

再添加 100 毫米准直镜头，带光纤适配器和单模光纤以及虹膜。然后使用光圈、光纤和透镜通过成像系统发送准直光束。接下来，在光束路径中最后一个准直透镜之前插入焦距 400 毫米的圆柱形透镜。

使用它对焦光束。在第一个镜头前面插入 50 毫米圆柱透镜 450 毫米。这是具有检测和激励路径的最终设置的示意图表示形式。

三个激光器的输出通过单模光纤耦合到路径中。用于测试准备 3D 水凝胶样品。这一个由20纳米深红色的珠子与水凝胶混合。

在设置处将水凝胶样品放在样品架中。用于样品激发打开 638 纳米激光器，并将其功率调整到小于 1 毫瓦。在内部触发模式下设置摄像机控制软件并捕获视频。

此时，galvo 电机已应用零伏特。放置相机，使图像位于镜头的中心。接下来，调整偶联图像平面的镜像。

旋转镜子上的水平旋钮，以实现高度倾斜的照明。用 20 纳米磁珠记录 3D 水凝胶的荧光样品图像中的瓷砖图像。比例尺为 20 微米。

设置硬件和软件以扫描 galvo 镜像后继续。这是用于设置的 galvo 镜像扫描软件。通过将 Vmin 设置为负 500 毫伏来安排全视场成像。

然后将 Vmax 设置为 500 毫伏。接下来，切换到摄像机采集软件。在"触发模式"中选择"外部"。

在"光扫描 PLUS"下拉菜单下选择"下一步"，单击"扫描速度控制"。现在可以设置某些控制参数。"窗口高度"下输入 180 行。

"曝光"下输入 28 毫秒。完成后，返回到镜像控制软件。在 3D 堆栈上的镜像控制软件开关中。打开。指定堆栈的数量和步进大小。

单击"拍摄视频"开始录制图像。这是单链标记DNA的Epi成像的一个例子。相比之下，高度倾斜的扫描瓷砖技术产生了此图像。

与 Epi 图像相比，HIST 图像显示的背景较少。DNA在3D水凝胶中，激发波长为638纳米。这里是标有真核翻译伸长因子2的Epi图像。

HIST 图像提高了信和背景比。它还具有更均匀的照明。两者都具有相同的 7.5 毫瓦照明功率。

成像速度都是每秒 2.5 帧。保持高倾斜角，并同步扫光镜与摄像机读出，这一点很重要。这保证了在图像采集过程中的高信号与背景比。

我们预计，HIST显微镜将受益于多种应用，包括更深成像深度的超分辨率成像和厚组织切片的高通量基因表达分析。