Este video proporcionará protocolos detallados para experimentos de forma in vitro para determinar la estructura secundaria de las secuencias de ARN de interés en presencia de un ARN dirigido a moléculas pequeñas. La forma in vitro es un método rentable para entender la dinámica de cada nucleótido en un elemento de ARN de tamaño amino que suele ser inferior a 200 nucleótidos. Después de preparar la plantilla de ARN como se describe en el manuscrito, la etiqueta de radio invierte las imprimaciones de transcripción inversa mediante la adición de un GAMMA 32P ATP, imprimación de transcripción invertida.
Tampón de reacción 10XPNK, polinucleótido quinasa y agua libre de ARN en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros en un volumen total de 20 microlitros. Luego incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, active las muestras durante 20 minutos desde 65 grados Celsius y luego filtre las muestras en una columna de desaladora y centrífuga a 1000 veces G.Add 25 microlitros de búfer de muestra de urea 2XTBE y mezcle.
Baje estos productos etiquetados en un gel de 10% acrilamida y asegúrese de evitar sangrar la radiactividad en los depósitos superiores. Ejecute el gel a 20 vatios durante una hora. Después de la carrera, retire las placas de vidrio del cassette de gel.
Poner el gel sobre la pieza de plástico. Dobla el plástico sobre la parte superior del gel para hacer un sándwich hermético. Coloque el sándwich de gel en una pantalla de fósforo de calcio-tungstato y exponga con un instrumento imaginador.
Vuelve a tomar una imagen del gel con luz regular para saber dónde están los bordes del gel. Utilice un software de procesamiento de imágenes para superponer las dos imágenes y superponer las imágenes claras y oscuras. A continuación, haga que la imagen superior sea ligeramente opaca para ver ambas imágenes simultáneamente.
Asegúrese de que la imagen impresa tenga el mismo tamaño que el gel real. A continuación, alinee el gel en la imagen impresa. Por último, utilice una cuchilla de afeitar esterilizada para cortar los pliegues deseados del gel y coloque cada pieza de gel en un tubo de microcentrífuga separado de 1,7 mililitros.
Para recuperar el ADN de la rebanada de gel por elución pasiva, agregue 0,3 mililitros de mezcla de precipitación de elución a cada tubo de 1,7 mililitros. Incubar los tubos en un recipiente seguro radioactivo en un rotador a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, transfiera el líquido a un nuevo tubo de 1,7 mililitros.
Añadir 2.5x hielo frío 200 etanol a prueba e invertir los tubos seis veces para mezclar el líquido. Incubar los tubos a menos 80 grados centígrados durante un mínimo de una hora. Después de centrifugar a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, retire el sobrenadante cuidadosamente pipeteando.
Añadir un mililitro de 80%etanol para lavar el pellet. Vórtice durante 15 segundos y centrifugar de nuevo en las mismas condiciones. Después de retirar el sobrenadante por pipeteo, seque al aire el pellet de ADN durante cinco minutos.
Agregue 50 microlitros de agua libre de ARN y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Normalice la concentración de ADN a unos 100.000 recuentos por minuto por microlitro en un contador de centelleo. Para preparar cuatro muestras para su modificación química, añada ocho picomoles de ARN en 32 microlitros de 0,5 Tampón XTE a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.
Calienta a 80 grados Centígrados durante dos minutos y enfría el hielo durante al menos un minuto. A continuación, añadir ocho microlitros de mezcla plegable 5x, mezclar un asignar nueve microlitros de esta mezcla de ARN en cada uno de los cuatro tubos de PCR, etiquetados de uno a cuatro. Agregue un microlitro de 10%DMSO al tubo marcado como uno, un microlitro de solución de moléculas pequeñas concentrada en el tubo dos, un microlitro de solución de moléculas pequeñas diluidas en el tubo tres y un microlitro de agua en el tubo cuatro.
Incubar todos los tubos PCR a 37 grados centígrados en un ciclor térmico durante 30 minutos. Inmediatamente antes de la reacción de modificación de dos oh primera, diluir un microlitro de dos soluciones de NAI molar en tres microlitros de agua tratada con DEPC para producir una solución de trabajo molar de 0,5. Agregue inmediatamente un microlitros de esta solución en los tubos uno, dos y tres.
Añadir un microlitro de 25%DMSO en el tubo cuatro e incubar en un ciclor térmico a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Prepare cuatro tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 mililitros y añada 100 microlitros de mezcla de precipitación de elución y dos microlitros de glucógeno a cada tubo. A continuación, en cada uno de estos tubos transferir todo el líquido de los tubos PCR correspondientes.
Agregue 0,34 mililitros de etanol a prueba de 200 helados en cada tubo y mezcle por vórtice durante cinco segundos. Coloque los tubos en un congelador de menos 80 grados Centígrados durante al menos una hora. Luego centrifuga los tubos durante 15 minutos a 14.000 veces G a cuatro grados centígrados.
Sin alterar el pellet de ARN, retire el sobrenadante de cada tubo. Añadir 0,5 mililitros de 80% de etanol por tubo para lavar el pellet de ARN y el vórtice durante 15 segundos. Después de centrifugar en las mismas condiciones de nuevo, retire el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN durante cinco minutos.
Agregue nueve microlitros de agua y tuberías libres de ARN que suelen y bajen 10 veces para mezclar. Transfiera el ARN modificado en cuatro nuevos tubos pcR y etiquete uno a cuatro como en el paso anterior. Agregue dos picomoles de ARN en siete microlitros de agua tratada con DEPC a cada uno de los cuatro tubos de PCR adicionales y etiquete con los números cinco a ocho.
Agregue dos microlitros de la imprimación radiomarcada recuperada a cada uno de los ocho tubos pcR marcados de uno a ocho. Después de calentar a 65 grados Celsius durante cinco minutos, se enfríe inmediatamente a cuatro grados Celsius en el ciclor térmico. Agregue cuatro microlitros de tampón RT 5x, un microlitro de TDT molar 0.1 y un microlitro de mezcla DNTP a cada uno de los tubos.
A continuación, agregue dos microlitros de agua tratada con DEPC a los tubos de uno a cuatro. Añadir cuatro microlitros de cinco ddATP mililolares al tubo cinco, cuatro microlitros de cinco ddTTP milimotores al tubo seis y cuatro microlitros de cinco ddCTP mililolares al tubo siete y un microlitro de cinco mililitros de ddGTP y tres microlitros de agua tratada con DEPC al tubo ocho y pipeta cuatro veces para mezclar. Después de calentar todos los tubos pcR a 52 grados Celsius durante un minuto en un ciclo térmico, agregue un microlitro de transcriptasa inversa a cada tubo y pipeelo hacia arriba y hacia abajo cuatro veces para mezclar.
Incubar las reacciones a 52 grados centígrados durante 20 minutos en el ciclor térmico. Para hidrolizar el ARN, agregue un microlitro de cinco molares de hidróxido de sodio en cada uno de los tubos y calientelos a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue cinco microlitros de un ácido clorhídrico molar para neutralizar la reacción y repetir la precipitación de etanol como se describió anteriormente.
Después de secar al aire el pellet de ADN durante cinco minutos, agregue 10 microlitros de agua y 10 microlitros de tampón de carga de muestra de urea 2xTBE en tubos de 1,7 mililitros y entubarlo hacia arriba y hacia abajo 10 veces para redissolve. Calienta las muestras a 70 grados centígrados durante cinco minutos, luego coloca los tubos sobre hielo, antes de cargarlos sobre el gel. Cargue 10 microlitros de la muestra que se ha colocado sobre hielo en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 8%.
Ejecute el gel a 65 vatios durante dos horas o hasta que el tinte inferior alcance los 3/4 del gel. Retire el espaciador e inserte suavemente una espátula para quitar la placa de vidrio siliconizado superior. Cubra el gel con un pedazo de papel de filtro grande y presione suavemente para permitir que el gel se adhiera al papel de filtro.
A partir del extremo inferior, levante el papel del filtro y retire el gel de la placa de vidrio junto con el papel. Después de transferir el gel a un papel de envoltura como se había hecho anteriormente, séquelo a 70 grados Celsius durante una hora con una aspiradora, asegurándose de usar varios papeles de filtro entre el gel y la secadora. Transfiera el sándwich de gel a un casete de pantalla de almacenamiento de fósforo foto blanqueado y exponga la radiactividad del gel a la pantalla durante cuatro a 16 horas.
Por último, coloque la pantalla de almacenamiento de fósforo en un dispositivo de imágenes y escanee con una resolución media durante aproximadamente 30 minutos. Después de exponer el gel de secuenciación de poliacrilamida a la pantalla de almacenamiento de fósforo, un experimento de forma exitoso mostró una sola y más intensa curvatura en la parte superior del gel y se dobla a lo largo del gel con una sola resolución de nucleótido sin frotis. El gel también mostró que la intensidad de algunas curvas cambió en presencia de moléculas pequeñas, lo que indica cambios en la fuerza de emparejamiento base.
Un problema común en el análisis de página es que una región de frotis conocida como el frente de sal puede aparecer en el medio del gel, probablemente debido a la alta concentración de sal, DMSO u otra sustancia no deseada en la muestra de carga. Eso se puede evitar mediante la eliminación de la sustancia no deseada por precipitación de etanol. Una plantilla de ARN homogénea es preferible para la forma in vitro.
Usamos ribosomas en cinco extremos primos y tres primos para obtener tal ARN. La forma en la célula también se puede realizar para obtener la estructura secundaria del ARN en el contexto celular. Recuerde que la forma in vitro puede no recapitular interacciones in vivo de proteínas de unión al ARN.
La forma in vitro es un método potente para detectar cambios en la estructura del ARN debido a la presencia de una molécula pequeña. Esto se hace cuantificando los cambios en la fuerza de patrón de las paradas de transcriptasa inversa. Tenga cuidado de que todos los experimentos descritos en este video se realicen en un lugar de trabajo radiactivo autorizado con protección personal adecuada y blindaje de plexiglás.
