Presentamos el primer modelo de cultivo celular para la infección por poliomavirus celular de Merkel. El protocolo incluye el aislamiento de los fibroblastos dérmicos, la preparación de la infección por el virus MCPyV, la tinción inmunofluorescente y la hibridación fluorescente in situ. Este protocolo permite estudiar el ciclo infeccioso del MCPyV y las interacciones con las células huésped, evitando al mismo tiempo los artefactos asociados con la sobreexpresión de genes virales.
Para empezar, usa un par de tijeras para cortar la grasa y el tejido subcutáneo del prepucio neonatal humano. Corte la muestra de piel en mitades o cuartos. Colocar el tejido en 5 mililitros de 10 miligramos por mililitro desinfado II NPBS, complementado con antibiótico-antimicótico.
Incubar a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, usa fórceps de microdisección para separar cuidadosamente la epidermis de las capas dérmicas en una placa de 10 centímetros. Transfiera el tejido dérmico resultante a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 5 mililitros de 2 miligramos por mililitro de colágeno tipo IV en un medio libre de FBS complementado con antibiótico-anitmicótico.
Incubar la muestra a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono con temblores periódicos durante cuatro a seis horas, hasta que sólo queden unos pocos agregados de tejido macroscópico. Después de esto, utilice una pipeta de 10 mililitros para pipetear la solución de muestra hacia arriba y hacia abajo vigorosamente 10 veces, liberando células individuales de la dermis. Centrifugar a 180 g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.
Placar las células disociadas en medio DMEM suplementado. Por la tarde o por la noche, sembra 6 millones de células 293TT28 en un plato de 10 centímetros que contiene un medio DMEM suplementado. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
A la mañana siguiente, asegúrese de que las células son aproximadamente 50%confluentes, luego transfect las células con 66 microlitros de reactivo de transfección, 12 microgramos de ADN R17B aislado de MCPyV re-ligado, 8,4 microgramos de pMtB de plásmido de expresión ST, y 9,6 microgramos de plásmido de expresión LT pADL. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, cuando las células trans infectadas son casi confluentes, tripas las células y las transfiere a un plato de 15 centímetros para una expansión continua.
Cuando ese plato se vuelva casi confluente, transfiera las células a tres nuevos platos de 15 centímetros. Cuando esos nuevos platos se vuelvan casi confluentes, cosecha las células como se describe en el protocolo de texto. Centrifugar a 180 g a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, retire el sobrenadante y agregue un volumen celular de magnesio DPBS. Añadir 25 sulfatos micromolares de amonio, seguidos de 0.5%Triton X-100, 0.1%benzonasa, y 0.1% de un DNAse dependiente de ATP. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, enfríe la mezcla sobre hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue 0,17 volumen de cloruro de sodio. Mezclar e incubar sobre hielo durante otros 15 minutos.
Centrifugar a 12 mil g a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no está claro, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación. Después de esto, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
Resuspender el pellet en 1 volumen de DPBS complementado con 0,8 moles de cloruro de sodio. Centrifugar a 12 mil g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no está claro, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación.
Combine los dos sobrenadantes y centrifugar de nuevo a 12 mil g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta para depositar gradientes de iodixanol en tubos de polialómero de cinco mililitros de paredes delgadas como se describe en el protocolo de texto. Cargue 3 mililitros del sobrenadante que contiene virus clarificado encima del gradiente de yodoxanol preparado.
Centrifugar con un rotor SW 55 Ti a 234 mil g y a 16 grados Celsius durante 3,5 horas, asegurándose de reducir la aceleración y la desaceleración. Una vez completada la ultracentrifugación, recoja 12 fracciones en tubos siliconizados. Después de mantener y separar las células, a 10 mililitros de DMEM suplementado y F12 medio al plato.
Transfiera la solución celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 180 g durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio DMEM y F12 suplementado con una densidad celular entre 20 mil y 40 mil células por mililitro.
Luego, semilla 200 o 400 microlitros de la suspensión celular complementados con 1 miligramo por mililitro de colágeno tipo IV en cada pozo de una placa de 24 o 96 pozos, respectivamente. Retire el material de viron MCPyV del congelador Celsius de menos 80 grados y colóquelo sobre hielo para descongelarlo. Agregue 1 mil millones de equivalentes de genoma viral de viriones MCPyV por un microlitro de yodoxanol por cada 2500 a 5000 células que se infecten.
Toque suavemente el lado de la placa e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Primero, fija las células en los resbalones de la cubierta con 4%PFA en PBS durante 10 minutos, luego lava los resbalones de la cubierta dos veces con PBS y trátalos con 70% de etanol a cuatro grados Celsius durante la noche para permeabilizar las células. Al día siguiente, reemplace el etanol con el tampón de hidratación de la sonda e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos para pre-hibridación de las muestras.
30 minutos antes del final de la incubación previa a la hibridación, diluir las sondas en la solución de hibridación de sondas a una dilución de 1:500 e incubar a 45 grados centígrados. Una vez completadas las incubaciones, pipetee aproximadamente 10 microlitros de la mezcla de sonda diluida en un portaobjetos del microscopio para cada resbalón de cubierta. Coloque cada lado de la celda deslizante de la cubierta hacia abajo en su gota respectiva de mezcla de hibridación.
Usando una cantidad liberal de cemento de goma, sellar los bordes y la parte posterior de cada cubierta se deslizan a su diapositiva. Ajuste la corredera en el lado plano de un bloque de calor y caliente a 94 grados Celsius durante tres minutos. Después de esto, transfiera el portaobjetos a una cámara humidificada e incubarlos a 45 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, utilice fórceps para despegar cuidadosamente el cemento de goma. Coloque la cubierta desliza el lado de la celda hacia arriba en los pozos de una placa de 24 pozos y lávelos con tampón de lavado de sonda tres veces a temperatura ambiente. Añadir 200 microlitros de tampón de amplificación a cada pocótetro que contenga un resbalón de cubierta e incubar a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.
Mientras tanto, recose cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos etiquetadas reconociendo las sondas en tubos PCR separados calentándolas a 94 grados centígrados durante 90 segundos, y luego enfriándolas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mezclar las horquillas en tampón de amplificación en una dilución de 1:50. A continuación, estirar la película de parafina sobre la cara abierta de una tapa de placa de 12 pozos para hacer una superficie para la reacción de amplificación.
Pipeta 50-100 gotas de microlitro de la mezcla de horquillas en la película de parafina para cada resbalón de cubierta. Con fórceps, retire cuidadosamente cada resbalón de la cubierta de la solución de preamplificación y toque el borde hasta una toallita desechable porosa para secar. Coloque cada lado de la celda del resbalón de la cubierta seca hacia abajo en una gota de amplificación.
Transfiera la tapa de la placa a una cámara humidificada e incubar durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad. Al día siguiente, devuelva los recibos de la cubierta a los pozos de la placa de 24 pozos. Añadir 5X SSCT que contenga DAPI a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora.
Después de esto, lave las muestras dos veces con 5X SSCT a temperatura ambiente. Monte los resbalones de la cubierta lavada en los portaobjetos del microscopio y utilice un microscopio de fluorescencia invertido para analizar las células y la imagen de las muestras. En este estudio, se aísla una población casi homogénea de fibroblastos dérmicos humanos.
La tinción inmunofluorescente revela que casi el 100% de las células dérmicas humanas aisladas se tiñen positivamente para marcadores de fibroblastos dérmicos, vimentina y colágeno, pero negativas para el marcador de queratinocitos de preescero humano K14. A continuación, se generan viriones MCPyV y después de visualizar la banda de viriones MCPyV concentrada en el núcleo del gradiente, se recogen 500 fracciones de microlitros y se realiza MCPyV qPCR para identificar las fracciones máximas. Las imágenes manchadas inmunofluorescentes de HDF infectados con MCPyV se muestran aquí, donde las células que son LT positivas, VP1 positivas o LT y VP1 positivas se consideran positivas para la infección por MCPyV.
Más del 30% de las células son LT positivas, y más del 10% son VP1 positivas. Los genomas MCPyV replicados en las células infectadas se detectan utilizando tanto el PECE DE ADN HCR como el FISH de ADN inmunofluorescente. Mientras que el FISH DE ADN-HCR revela la localización del ADN MCPyV presente en la fábrica de replicación, los métodos de PECES inmunofluorescentes-HCR-ADN permiten la detección simultánea de ADN MCPyV y la co-localización de proteínas LT en los centros de replicación.
Para lograr la mejor eficiencia de infección por virus, es muy importante que el MCPyV se concentre al menos en 2 x 10 a 8o genoma del virus por microlitro ya que el iodoxanol es tóxico para las células. Después de la infección por MCPyV de los fibroblastos dérmicos, se pueden realizar muchos análisis biológicos moleculares, incluyendo inmunofluorescencia, inmunobloqueo, inmunopositivicción y ensayo basado en qPCR. El sistema de infección que hemos descrito hace posible que los investigadores estudien etapas de la infección por MCPyV como el tráfico nuclear y el empaquetado viral.
MCPyV es un virus BSL-2, pero poco se sabe sobre su potencial de patología en las cantidades alcanzadas en un entorno de laboratorio. Por lo tanto, los investigadores deben tomar precauciones para evitar la exposición al virus.
