Wir stellten das erste Zellkulturmodell für die Infektion mit dem Merkel-Zell-Polyomavirus vor. Das Protokoll umfasst die Isolierung der dermalen Fibroblasten, die Vorbereitung der MCPyV-Virusinfektion, immunfluoreszierende Färbung und die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung. Dieses Protokoll ermöglicht es, den MCPyV-Infektiösen Zyklus und Wechselwirkungen mit Wirtszellen zu untersuchen und dabei Artefakte zu vermeiden, die mit einer Überexpression viraler Gene verbunden sind.
Um zu beginnen, verwenden Sie eine Schere, um das Fett und das unterkutane Gewebe von der menschlichen neonatalen Vorhaut zu trimmen. Schneiden Sie die Hautprobe in Hälften oder Viertel. Legen Sie das Gewebe in 5 Milliliter von 10 Milligramm pro Milliliter dis-basierte II NPBS, ergänzt mit Antibiotika-Antimykotik.
Inkubieren Bei 4 Grad Celsius über Nacht. Verwenden Sie am nächsten Tag Mikrodissektionszangen, um die Epidermis in einer 10-Zentimeter-Schale sorgfältig von den dermalen Schichten zu trennen. Übertragen Sie das resultierende dermale Gewebe in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 5 Millilitern von 2 Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ IV in FBS-freiem Medium, ergänzt mit Antibiotika-Anitmycotika.
Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit periodischem Schütteln für vier bis sechs Stunden, bis nur noch wenige makroskopische Gewebeaggregate übrig sind. Danach verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Probenlösung 10 Mal kräftig nach oben und unten zu pipetten und einzelne Zellen von der Dermis freizusetzen. Zentrifugieren Sie bei 180 g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Die dissoziierten Zellen in ergänztem DMEM-Medium verplatten. Am späten Nachmittag oder Abend, Samen 6 Millionen 293TT28 Zellen in einem 10-Zentimeter-Schale mit ergänztem DMEM Medium. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Morgen stellen Sie sicher, dass die Zellen etwa 50% konfluent sind, dann transfekieren Sie die Zellen mit 66 Mikroliter Transfektionsreagenz, 12 Mikrogramm religiertem MCPyV-Isolat R17B-DNA, 8,4 Mikrogramm ST-Expressionsplasmid pMtB und 9,6 Mikrogramm LT-Expressionsplasmid pADL. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag, wenn die transfizierten Zellen fast konfluent sind, versuchen sie die Zellen und übertragen sie auf eine 15-Zentimeter-Schale für die weitere Expansion.
Wenn dieses Gericht fast konfluent wird, übertragen Sie die Zellen in drei neue 15-Zentimeter-Gerichte. Wenn diese neuen Gerichte fast konfluent werden, ernten Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Zentrifuge bei 180 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie ein Zellvolumen von DPBS Magnesium hinzu. Fügen Sie 25 mikromolares Ammoniumsulfat hinzu, gefolgt von 0,5%Triton X-100, 0,1%Benzonase und 0,1% einer ATP-abhängigen DNAse. Gut mischen und bei 37 Grad Celsius über Nacht bebrüten.
Am nächsten Tag die Mischung auf Eis für 15 Minuten abkühlen. Als nächstes fügen Sie 0,17 Volumen Natriumchlorid hinzu. Mischen und auf Eis für weitere 15 Minuten inkubieren.
Zentrifuge bei 12 Tausend g bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Wenn der Überstand nicht klar ist, invertieren Sie das Rohr vorsichtig und wiederholen Sie die Zentrifugation. Danach übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre.
Setzen Sie das Pellet in 1 Volumen Von DPBS, ergänzt mit 0,8 Mol Natriumchlorid, wieder auf. Zentrifuge bei 12 Tausend g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Wenn der Überstand nicht klar ist, invertieren Sie das Rohr vorsichtig und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Kombinieren Sie die beiden Übersprecher und Zentrifuge wieder bei 12 Tausend g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Verwenden Sie dann eine Pipette, um Gradienten von Iodixanol in dünnwandige Fünf-Milliliter-Polyallomer-Röhren zu deponieren, wie im Textprotokoll beschrieben. 3 Milliliter des geklärten virushaltigen Überstandes auf den vorbereiteten Iodixanolgradienten laden.
Zentrifuge mit einem SW 55 Ti Rotor bei 234 Tausend g und bei 16 Grad Celsius für 3,5 Stunden, um sicherzustellen, dass die Beschleunigung und Verzögerung zu verlangsamen. Nach Abschluss der Ultrazentrifugation 12 Fraktionen in silikonisierten Rohren sammeln. Nach der Aufrechterhaltung und Ablösung der Zellen, bei 10 Milliliter von ergänztDMEM und F12 medium zur Schale.
Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15-Milliliter-Rohr. Zentrifuge bei 180 g für zwei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in ergänztem DMEM- und F12-Medium bei einer Zelldichte zwischen 20 Tausend und 40 Tausend Zellen pro Milliliter wieder auf.
Dann, Samen 200 oder 400 Mikroliter der Zellsuspension ergänzt mit 1 Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ IV in jedem Brunnen einer 24 oder 96 Brunnenplatte, bzw.. Entfernen Sie den MCPyV Viron-Bestand aus dem Minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und legen Sie auf Eis aufTauen. Fügen Sie 1 Milliarde virale Genomäquivalente von MCPyV-Virionen pro mikroliter Iodixanol für jede 2500 bis 5000 zu befallende Zelle hinzu.
Tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte und brüten Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Fixieren Sie zunächst die Zellen mit 4%PFA in PBS für 10 Minuten auf Abdeckungsslips, dann waschen Sie die Abdeckungsrutschen zweimal mit PBS und behandeln Sie sie mit 70% Ethanol bei vier Grad Celsius über Nacht, um die Zellen zu durchdringen. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Ethanol durch einen Sondenhydrierungspuffer und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 60 Minuten, um die Proben vorzuhybridisieren.
30 Minuten vor dem Ende der Vorhybridisierungsinkubation die Sonden in der Sondenhybridisierungslösung bei einer Verdünnung von 1:500 verdünnen und bei 45 Grad Celsius inkubieren. Wenn die Inkubationen abgeschlossen sind, pipette ca. 10 Mikroliter des verdünnten Sondengemisches auf einen Mikroskopschlitten für jeden Abdeckungsschlupf. Platzieren Sie jede Abdeckung Slip-Zelle Seite nach unten auf seinem jeweiligen Tröpfchen der Hybridisierung smisch.
Mit einer liberalen Menge an Gummizement, versiegeln Sie die Kanten und Rückseite jeder Abdeckung rutschen zu seinem Schlitten. Stellen Sie die Rutsche auf der flachen Seite eines Wärmeblocks ein und erhitzen Sie sie drei Minuten lang auf 94 Grad Celsius. Danach die Rutsche in eine befeuchtete Kammer überführen und bei 45 Grad Celsius über Nacht bebrüten.
Verwenden Sie am nächsten Tag die Zange, um den Gummizement vorsichtig abzuschälen. Legen Sie die Abdeckung die Zellseite in die Brunnen einer 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal bei Raumtemperatur mit Sondenwaschpuffer. Fügen Sie 200 Mikroliter Verstärkungspuffer zu jedem Brunnen mit einem Abdeckungsschlupf hinzu und brüten Sie bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten.
In der Zwischenzeit, anneal jeder der beiden markierten Oligonukleotid Haarnadeln erkennen die Sonden in separaten PCR-Röhren durch Erhitzen sie auf 94 Grad Celsius für 90 Sekunden, und dann kühlen sie auf Raumtemperatur für 30 Minuten. Mischen Sie die Haarnadeln in Verstärkungspuffer bei einer Verdünnung von 1:50 zusammen. Als nächstes dehnen Paraffinfilm über die offene Fläche eines 12 WellPlattendeckels, um eine Oberfläche für die Amplifikationsreaktion zu machen.
Pipette 50-100 Mikroliter Tröpfchen der Haarnadelmischung auf den Paraffinfilm für jeden Abdeckungsschlupf. Entfernen Sie mit Zangen vorsichtig jeden Deckelschlupf aus der Vorverstärkungslösung und berühren Sie die Kante zu einem porösen Einwegtücher zum Trocknen. Legen Sie jede getrocknete Abdeckung Rutschen Zelle Seite nach unten auf eine Amplifikationströpfchen.
Den Plattendeckel in eine befeuchtete Kammer geben und über Nacht bei Raumtemperatur und Dunkelheit bebrüten. Am nächsten Tag, zurück die Abdeckung rutscht zu den Brunnen der 24 Brunnen Platte. Fügen Sie 5X SSCT mit DAPI in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Danach die Proben zweimal mit 5X SSCT bei Raumtemperatur waschen. Montieren Sie die gewaschenen Abdeckungsrutschen auf Mikroskopschlitten und verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen zu analysieren und die Proben abzubilden. In dieser Studie wird eine nahezu homogene Population menschlicher dermaler Fibroblasten isoliert.
Immunfluoreszierende Färbung zeigt, dass fast 100% der isolierten menschlichen dermalen Zellen für dermale Fibroblastenmarker, Vimentin und Kollagen positiv gefärbt sind, aber negativ für den menschlichen Vorhautkeratinozytenmarker K14. MCPyV-Virionen werden dann erzeugt und nach der Visualisierung des Bandes von MCPyV-Virionen, die im Kern des Gradienten konzentriert sind, werden 500 Mikroliterfraktionen gesammelt und MCPyV qPCR durchgeführt, um die Spitzenfraktionen zu identifizieren. Immunfluoreszierende gebeizte Bilder von mit MCPyV infizierten HDFs werden hier gezeigt, wo Zellen, die LT-positiv, VP1-positiv oder sowohl LT- als auch VP1-positiv sind, als positiv für mcPyV-Infektionen angesehen werden.
Über 30% der Zellen sind LT-positiv und mehr als 10% sind VP1-positiv. Die in den infizierten Zellen replizierten MCPyV-Genome werden sowohl mit dem HCR-DNA FISH als auch mit Immunofluorescent-HCR-DNA FISH nachgewiesen. Während der HCR-DNA FISH die Lokalisierung der MCPyV-DNA in der Replikationsfabrik zeigt, ermöglichen die Immunofluoreszenz-HCR-DNA-FISH-Methoden den gleichzeitigen Nachweis von MCPyV-DNA und LT-Protein-Kolokalisierung in den Replikationszentren.
Um die beste Virusinfektionseffizienz zu erreichen, ist es sehr wichtig, dass MCPyV auf mindestens 2 x 10 bis 8. Virusgenom pro Mikroliter konzentriert ist, da Iodoxanol für die Zellen giftig ist. Nach der MCPyV-Infektion der dermalen Fibroblasten können viele molekularbiologische Analysen durchgeführt werden, einschließlich Immunfluoreszenz, Immunblocking, Immunpositivication und qPCR-basierter Assay. Das Infektionssystem, das wir beschrieben haben, ermöglicht es Forschern, Stadien von MCPyV-Infektionen wie nuklearen Handel und virale Verpackungen zu untersuchen.
MCPyV ist ein BSL-2-Virus, aber wenig ist über sein Potenzial für Pathologie in den Mengen in einem Labor-Umgebung erreicht bekannt. Daher sollten Forscher Vorkehrungen treffen, um eine Exposition gegenüber dem Virus zu vermeiden.
