MUB40 es un nuevo marcador de neutrófilos, que se une a la lactoferrina y permite una detección específica en humanos y todas las muestras de tejido de mamíferos probadas hasta ahora. Etiquetar neutrófilos con MUB40 es fácil, rápido y específico. Ahora se utiliza ampliamente en nuestro laboratorio y la implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico de enfermedades inflamatorias.
Para empezar, prepare las soluciones uno, dos y tres de acuerdo con el protocolo de texto, y colóquelas en un gabinete anóxico durante la noche. Luego, centrifugar los tubos de sangre recolectada a 650 g durante 20 minutos para separar las células de la fracción plasmática. Sin alterar la sangre separada, transfiera los tubos al gabinete anóxico y transfiera las fracciones de plasma a un tubo cónico de 50 mililitros.
Después de esto, retire el tubo de plasma del armario anóxico y centrifugarlo a 2900 g durante 20 minutos. Teniendo cuidado de no interrumpir las plaquetas peletadas, transferir el tubo al gabinete anóxico y pipetear el plasma pobre de plaquetas en un tubo fresco de 50 mililitros. Usando los tubos de recolección de sangre, combine los glóbulos rojos en un tubo cónico de 50 mililitros.
A continuación, agregue 0,9% de solución de cloruro de sodio hasta que el volumen total alcance los 44 mililitros y agregue seis mililitros de 6% dextran. Invierta el tubo de 10 a 20 veces para mezclar suavemente la sangre y la mezcla de dextrán, y deje que el tubo se sedimente durante al menos 30 minutos. Mientras que los sedimentos del tubo, preparar un gradiente Percoll mediante la adición de 4,2 mililitros de solución de Percoll a 5,8 mililitros de plasma, e invertir el tubo para mezclar.
A continuación, recoger el neutrófilo que contiene la fracción superior del dextrán, teniendo cuidado de no pipetear los glóbulos rojos. Apriete la tapa del tornillo, retire el tubo de dextrán del gabinete anóxico y centrifugar el tubo a 300 g durante 10 minutos. Teniendo cuidado de no molestar las células peletónicas, coloque el tubo de nuevo en el gabinete anóxico.
A continuación, retire el líquido pipeteando. Resuspender suavemente el pellet en un mililitro de plasma. Agregue lentamente las células resuspendidas a la parte superior de la solución Percoll.
Retire cuidadosamente el tubo de solución Percoll del gabinete anóxico y centrifúelo a 800 g durante 20 minutos para separar los PBMC de los neutrófilos. A continuación, prepare 14 mililitros de solución de tampón de lavado de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, coloque el tubo Percoll en el gabinete anóxico.
Utilice una pipeta para eliminar el Percoll y los PBMC y resuspender el neutrófilo que contiene el pellet en un mililitro de solución tampón de lavado. A continuación, agregue 200 microlitros de cuentas magnéticas a las células resuspendidas. Mezcle e incuba suavemente las células y las perlas durante al menos 15 minutos.
Después de esto, lave una columna de separación dos veces, con dos mililitros de tampón de lavado. Mientras sostiene un nuevo tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna, pipetee lentamente la mezcla de glóbulos rojos neutrófilos a través de la columna. El flujo a través de la columna debe estar turbio y perder su color rojo, confirmando la separación total de los neutrófilos de los glóbulos rojos restantes.
Agregue dos mililitros de tampón de lavado a la parte superior de la columna y recoja el flujo a través en el mismo tubo. Al final de este lavado, el flujo debe ser claro. Mezcle suavemente el tubo de recogida para asegurarse de que los neutrófilos se distribuyen uniformemente.
Luego recogió 10 microlitros del flujo a través del conteo celular. Después de esto, retire el tubo neutrófilo del gabinete anóxico y centrifugar el tubo a 300 g durante 20 minutos. Coloque los neutrófilos sedimentados de nuevo en el gabinete anóxico y retire el tampón de lavado a través del pipeteo.
Luego, resuspender el pellet en plasma. Agregue un microlitro de RI-MUB40-Cy5 a un mililitro de RPMI-1640 medio, sin rojo fenol, y mezcle a través de pipeteo. A continuación, agregue un microlitrotro de solución FMLP y pipeta para mezclar.
Transfiera la mezcla a un plato de microscopía de fondo de vidrio. Luego agregue un volumen apropiado de células purificadas al plato. Por último, coloque el plato en un microscopio fluorescente invertido e inicie la adquisición de imágenes.
En este protocolo, MUB40 se utilizó en células vivas para detectar la secreción de neutrófilos tras la simulación con FMLP. La dinámica de la liberación del contenido del gránulo, incluida la lactoferrina, puede visualizarse con el tiempo, aquí en magenta. MUB40 se puede utilizar adicionalmente en neutrófilos fijos.
Aquí, fagociizing cuentas fluorescentes en una serie cronometaria. El contenido del gránulo de neutrófilos se etiqueta aquí en azul. Los neutrófilos mostraron poca o ninguna tinción celular en los primeros momentos y gradualmente, el etiquetado RI-MUB40 aumentó con el tiempo, tanto en la membrana plasmática como en la superficie del cordón.
MUB40 también se puede utilizar en tejidos inflamatorios fijos para detectar neutrófilos específicamente, como se muestra en las cifras del texto. Aquí describimos el procedimiento de purificación de neutrófilos, aplicado rutinariamente en nuestro laboratorio. Cualquier otro método es adecuado, el etiquetado MUB40-Cy5 seguirá funcionando.
El neutrófilo puede etiquetarse específicamente con MUB40 después de la purificación, o directamente en tejido inflamado de pacientes o modelos animales. Varios derivados MUB40 han sido diseñados para ampliar su uso. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la inflamación, explorara el reclutamiento neutrófilo y la activación en enfermedades inflamatorias.
