MUB40 é um novo marcador de neutrófilo, que se liga à lactoferrina e permite uma detecção específica em humanos e em todas as amostras de tecido de mamíferos testadas até agora. Rotular neutrófilos com MUB40 é fácil, rápido e específico. Agora é amplamente utilizado em nosso laboratório e a implicação dessa técnica se estende para o diagnóstico de doenças inflamatórias.
Para começar, prepare as soluções um, dois e três de acordo com o protocolo de texto, e coloque-as em um gabinete anoxico durante a noite. Em seguida, centrifugar os tubos de sangue coletado a 650 g por 20 minutos para separar as células da fração de plasma. Sem perturbar o sangue separado, transfira os tubos para o armário anoxico e transfira as frações de plasma para um tubo cônico de 50 mililitros.
Depois disso, remova o tubo de plasma do armário anoxico e centrífuga-o a 2900 g por 20 minutos. Tomando cuidado para não interromper as plaquetas pelleted, transferir o tubo para o armário anoxico e pipeta o plasma pobre plaqueta em um tubo fresco de 50 mililitros. Usando os tubos de coleta de sangue, combine os glóbulos vermelhos em um tubo cônico de 50 mililitros.
Em seguida, adicione 0,9% de solução de cloreto de sódio até que o volume total atinja 44 mililitros e adicione seis mililitros de 6% de dextran. Inverta o tubo 10 a 20 vezes para misturar suavemente a mistura de sangue e dextran, e deixe o tubo sedimentar por pelo menos 30 minutos. Enquanto os sedimentos do tubo, prepare um gradiente percoll adicionando 4,2 mililitros de solução Percoll a 5,8 mililitros de plasma, e inverta o tubo para misturar.
Em seguida, colete o neutrófilo contendo fração superior do dextran, tomando cuidado para não pipetizar glóbulos vermelhos. Aperte a tampa do parafuso, retire o tubo dextran do armário anoxico e centrífugue o tubo a 300 g por 10 minutos. Tomando cuidado para não perturbar as células pelleted, colocar o tubo de volta no armário anoxic.
Em seguida, remova o líquido por pipetação. Levemente resuspensar a pelota em um mililitro de plasma. Adicione lentamente as células resuspended aos topos da solução Percoll.
Remova cuidadosamente o tubo de solução Percoll do armário anoxico e centrífuga-o a 800 g por 20 minutos para separar os PBMCs dos neutrófilos. Em seguida, prepare 14 mililitros de solução de tampão de lavagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, coloque o tubo Percoll no armário anoxico.
Use uma pipeta para remover os Percoll e PBMCs e resuspenque o neutrófilo contendo pelota em um mililitro de solução tampão de lavagem. Em seguida, adicione 200 microliters de contas magnéticas às células resuspended. Misture suavemente e incuba as células e as contas por pelo menos 15 minutos.
Depois disso, lave duas vezes uma coluna de separação, com dois mililitros de tampão de lavagem. Enquanto segura um novo tubo cônico de 15 mililitros sob a coluna, pipeta lentamente a mistura de glóbulos vermelhos neutrófilos através da coluna. O fluxo da coluna deve ser nublado e perder sua cor vermelha, confirmando a separação total dos neutrófilos dos glóbulos vermelhos restantes.
Adicione dois mililitros de tampão de lavagem na parte superior da coluna e colete o fluxo através no mesmo tubo. Até o final desta lavagem, o fluxo deve ser claro. Misture suavemente o tubo de coleta para garantir que os neutrófilos sejam distribuídos uniformemente.
Em seguida, coletou 10 microliters do fluxo através da contagem celular. Depois disso, remova o tubo de neutrófilo do armário anoxico e centrífuga o tubo a 300 g por 20 minutos. Coloque os neutrófilos sedimentados de volta no armário anoxico e remova o tampão de lavagem através de pipet.
Então, resuspense a pelota no plasma. Adicione um microliter de RI-MUB40-Cy5 a um mililitro de meio RPMI-1640, sem vermelho fenol, e misture através de pipetagem. Em seguida, adicione um microliter de solução FMLP e pipeta para misturar.
Transfira a mistura para um prato de microscopia de fundo de vidro. Em seguida, adicione um volume apropriado de células purificadas ao prato. Por fim, coloque o prato em um microscópio fluorescente invertido e inicie a aquisição de imagens.
Neste protocolo, o MUB40 foi usado em células vivas para detectar secreção de neutrófilos após simulação com FMLP. A dinâmica do lançamento do conteúdo do grânulo, incluindo lactoferrina, pode ser visualizada ao longo do tempo, aqui em magenta. MUB40 pode ser usado adicionalmente em neutrófilos fixos.
Aqui, phagocytizando contas fluorescentes em uma série cronometrado. O conteúdo do grânulo de neutrófilo é rotulado aqui em azul. Os neutrófilos mostraram pouca ou nenhuma coloração celular nos primeiros pontos de tempo e gradualmente, a rotulagem RI-MUB40 aumentou ao longo do tempo, tanto na membrana plasmática quanto na superfície das contas.
MUB40 também pode ser usado em tecidos inflamatórios fixos para detectar neutrófilos especificamente, como mostrado nas figuras de texto. Descrevemos aqui o procedimento de purificação de neutrófilos, aplicado rotineiramente em nosso laboratório. Qualquer outro método é adequado, a rotulagem MUB40-Cy5 ainda funcionará.
O neutrófilo pode ser especificamente rotulado com MUB40 após a purificação, ou diretamente em tecido inflamado de pacientes ou modelos animais. Vários derivados MUB40 foram projetados para ampliar seu uso. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da inflamação, explorar o recrutamento neutrófilo e a ativação em doenças inflamatórias.
