Este método trata de describir tres métodos utilizados con frecuencia para evaluar la migración de neutrófilos normales in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en el modelo de artritis del ratón. Creemos que este método podría ser útil para otros investigadores en este campo. Este protocolo contiene los detalles metodológicos para evaluar la capacidad de migración de los neutrófilos en los sitios de inflamación mediante el uso de ensayo de bolsa de aire y artritis inducida por adyuvante.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de artritis comparando el grupo modelo con el grupo de tratamiento. Este método podría proporcionar información sobre la enfermedad inflamatoria y se puede aplicar a la enfermedad inflamatoria intestinal. Demostrando el procedimiento serán Qingyi Lu y Haixu Jiang, estudiantes de posgrado de nuestro laboratorio.
Después de la anestesia de los ratones en el día cero, utilice un filtro de 0,22 micras unido a una jeringa de cinco mililitros para obtener un volumen de tres mililitros de aire esterilizado. Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas y utilice por vía subcutánea una aguja de calibre 26 por 3/8 pulgadas para inyectar tres mililitros del aire esterilizado. Después del tratamiento, retire los ratones de la unidad respiratoria y colóquelos en una jaula bien establecida.
Monitoree a los ratones para asegurarse de que están vivos hasta que empiecen a moverse. En el tercer día, inyecte tres mililitros adicionales de aire esterilizado en la bolsa de aire previamente establecida para sostener la bolsa de aire. En el sexto día, inyecte diferentes tratamientos en la bolsa de aire.
Inyectar un mililitro de PBS como control negativo e inyectar un mililitro de un microgramo por mililitro de LPS como control positivo para inducir la inflamación local. Después de seis horas, sacrifica a los ratones. Para cada bolsa de aire, inyecte un mililitro de tampón de lavado para lavar la bolsa de aire y recoger el exudado inflamatorio en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
A continuación, lave la bolsa de aire con dos mililitros de tampón de lavado dos veces y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo centrífugo. Centrifugar a 100 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en un mililitro de tampón de lavado.
Cuente las células para cuantificar la relación de neutrófilos utilizando el analizador automático de hematología. Suspenda el adyuvante completo de Freund vórtice al menos cinco segundos y, a continuación, extraiga 100 microlitros de suspensión en un inyector de insulina. Después de anestesiar, marque la pata elegida e inyecte 20 microlitros del adyuvante completo de Freund desde el inyector en cuatro puntos periarticulares en el espacio de la articulación del tobillo.
Ponga los ratones procesados en la nueva cámara. Monitoree a los ratones para asegurarse de que están respirando hasta que recuperen la capacidad de moverse. Cada tres días, utilice un medidor de espesor de bolsillo para medir el diámetro de la articulación del tobillo.
Además, evalúe la gravedad de la artritis por criterio de puntuación de artritis. Cero es normal. No hay evidencia de eritema e hinchazón.
Una es la artritis más leve. Eritema e hinchazón leve confinada a los tarsales o a la articulación del tobillo. Dos es la artritis moderada.
Eritema e hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta los tarsales. Tres es la artritis grave. Eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsas.
Cuatro es la artritis más grave. El eritema y la hinchazón grave abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad. Después de sacrificar el ratón, retire la piel y parte del músculo de la pata trasera con pinzas y tijeras.
Rocíe la articulación con 70%etanol y retire el resto de los músculos con una toalla de papel. Fijar la articulación del tobillo en 4%paraformaldehído durante dos días a temperatura ambiente. A continuación, descalcificar la articulación en 10%EDTA durante un mes a temperatura ambiente y cambiar el medio semanalmente.
Después de un mes, coloque el tejido en un molde marcado con cierto volumen de parafina líquida a aproximadamente 60 grados Celsius para incrustar el tejido. Genial brevemente. Ajuste el grosor del microtoma a cuatro micrómetros y corte las rodajas.
A continuación, flotar las secciones en un baño de agua Celsius de 43 grados durante un corto tiempo para ampliar las secciones. Montar las secciones en los portaobjetos y poner los portaobjetos en el horno a 70 grados Celsius durante dos horas. Para uso futuro, conserve los portaobjetos a menos 20 grados Centígrados.
A continuación, coloque los portaobjetos en un estante y realice lavados en xileno y etanol de acuerdo con el manuscrito para rehidratar a temperatura ambiente. Por último, lave en agua corriente del grifo durante tres minutos. A continuación, manche en una solución verde 0,1% rápida durante cinco minutos.
Enjuagar en 1%ácido acético durante 10 segundos y manchar en 0.1%Solución de tinción de Safranin O durante 20 minutos. Después de eso, sumerja las diapositivas en las soluciones de lavado de xileno y etanol según el manuscrito. Monte las secciones de tejido en la etapa del objeto y observe los tejidos bajo un microscopio.
Para visualizar los neutrófilos, realice tinciones inmunohistoquímicas horneando primero las secciones de parafina durante dos horas a 78 grados centígrados. Coloque los portaobjetos en un estante y realice los lavados de xileno, etanol, agua y PBS de acuerdo con el manuscrito para rehidratar a temperatura ambiente. Luego agregue una gota de tamplismo de permeabilización para cubrir el tejido.
Incubar las secciones en una bandeja controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de eso, enjuague los portaobjetos en PBS durante tres minutos tres veces. Evite enjuagar el tejido directamente.
A continuación, realice la recuperación de epítopos de antígenos inducidos por el calor. Coloque las diapositivas en un bastidor. Sumerja los portaobjetos en la caldera de presión llena de búfer de recuperación.
Coloque la caldera de presión en el horno microondas y coloque el horno microondas a 600 vatios y caliente los portaobjetos durante 10 minutos. Después de hervir, mantenga los portaobjetos en la caldera para enfriar a 90 grados Celsius. Saque los portaobjetos y enjuáguelos en PBS durante tres minutos tres veces.
Para apagar la actividad de peroxidasa endógena, sumerja los portaobjetos en peróxido de hidrógeno 3% recién preparado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Enjuague los portaobjetos en PBS durante tres minutos tres veces. Esboza un gran círculo alrededor de la muestra con una pluma hidrófoba.
Evite tocar la muestra. Añadir en la muestra de 50 a 100 microlitros de albúmina sérica 3%bovina para bloquear y colocar las muestras en una cámara controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 60 minutos. A continuación, quite la solución de bloqueo.
Añadir 50 microlitros de anticuerpo primario diluido PBS a cada sección rápidamente. Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a cuatro grados centígrados durante la noche. En el segundo día, saque la bandeja y déjela reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, enjuague los portaobjetos en PBS tres minutos tres veces. Añadir 50 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos por PBS a los tejidos. Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, enjuague los portaobjetos en PBS tres minutos tres veces. Desarrollar en solución DAB diluida durante cinco minutos. Evitar el desarrollo de un color oscuro causado por la sobrerreacción del DAB.
Enjuague los portaobjetos con agua destilada. Contrate los portaobjetos en hematoxilina durante 10 segundos y enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante cinco minutos. Enjuagar en alcohol ácido solución de diferenciación súper rápida durante tres segundos, luego enjuague en agua del grifo durante 10 minutos.
Sumerja las diapositivas en los lavados de etanol y xileno a temperatura ambiente según el manuscrito. Fije el cubreobjetos con la solución de montaje. Observe el tejido bajo un microscopio.
En este estudio, se realizaron experimentos de bolsas de aire para investigar el reclutamiento de neutrófilos estimulado por LPS in vivo. Los subconjuntos de leucocitos en los exudados de la bolsa de aire eran mucho más altos que en el control. En comparación con el grupo de control, el grupo de artritis inducida por adyuvante mostró un edema significativo en la pata.
El diámetro de la articulación del tobillo aumentó y la puntuación de la artritis aumentó constantemente. El daño del cartílago es el síndrome representativo de la artritis reumatoide. El desafío de CFA indujo una gran cantidad de infiltración de leucocitos, erosión significativa del cartílago e hiperplasia sinovial.
MPO en cualquier nivel de expresión son marcadores representativos de infiltración de neutrófilos que fueron significativamente regulados en la sección conjunta. Asegúrese de que el aire se inyecta en la piel, pero no en el músculo. También podemos investigar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos mediante tinción inmunohistoquímica de las secciones del tejido articular del tobillo con anti-p84 o Estos métodos se pueden utilizar para estudiar otras enfermedades inflamatorias como la enfermedad inflamatoria intestinal.
