Name: determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
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Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5605100122001), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH), así como la Universidad de Nebraska en Kearney (UNK) verano estudiante investigación programa (SSRP) y UNK Beca de pregrado (URF).

1. preparación de colorantes, Buffers y Gel de la agarosa
<ol><li>
Preparar las siguientes soluciones para la tinción de ADN o la digestión de ADN teñido.
	<ol>
<li>Preparar 1 x TE (Tris-HCl y etilendiaminotetracético ácido; Tampón EDTA) con 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA en un cilindro graduado o un matraz aforado. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Hacer alícuotas de cada tinte: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabla 1). Pipetear 4 μL de colorante de 1 mM en un ámbar oscuro o negro tubo de 1,5 mL y añadir 36 μl de TE 1 x, mezclar con la pipeta; Esta concentración hace que una solución de tinte de 100 μm (total 40 μL). Completar este paso para cada colorante. Almacenar a 4 ° C. Nota: Evite exponer el tinte a la luz para evitar fotoblanqueo o degradación del colorante.</li>
		<li>Preparar el tampón 1 usando 10 mM Bis-Tris-propano-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL albúmina sérica bovina (BSA). Preparar el tampón 2 utilizando 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL de BSA. Preparar el tampón 3 utilizando 50 mM acetato de potasio, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL BSA. Cada enzima requiere uno de estos búferes específicos para funcionar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar las siguientes soluciones para la electroforesis del gel.
	<ol>
<li>Hacer 6 x carga del tinte azul, mediante la combinación de bromofenol 0.25% 0.25% xileno cyanol, 15% Ficoll en dH2O. almacén a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para hacer una agarosa 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarosa de temperatura (HGT) gelificación alta en un matraz Erlenmeyer, añadir 100 mL de buffer de x TAE 1 y coloque un vaso invertido sobre el matraz.<ol>
<li>Calentar la solución en una placa caliente hasta que las burbujas empiezan a formar en la parte inferior del matraz y flotador en la parte superior.</li>
			<li>Retirar la solución de la placa caliente, deje que la solución se enfríe hasta que el frasco puede ser tocado con la mano desnuda y luego Vierta el gel en un molde de gel de 24,5 x 21,8 cm con un peine de gel para crear pozos.</li>
			<li>Elimine las burbujas cerca del peine o en la superficie del gel por estallido con una punta de pipeta y permita que el gel se solidifique durante al menos 15 minutos. Esta puede almacenarse en un refrigerador (4 ° C) envuelto en plástico durante 1 semana prevenir el secado del gel o contaminación. Para obtener más información sobre cómo ejecutar un gel consulte Lee et al. 33 . Nota: Use un peine de gel con 30 pozos individuales. Cada uno debe ser 4,5 mm de ancho con una profundidad de 2 mm. La altura del pozo dependerá de la cantidad de gel en la caja.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar 1 buffer x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM y 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de DNA manchada
<ol><li>
Lambda DNA (300-800 ng) con alícuotas diferentes de tintes de la mancha. Cada tinte (tabla 1) tendrá seis diferentes concentraciones probadas, para un total de 48 reacciones por enzima de la restricción. El siguiente proceso describe un conjunto para arriba para la 1 reacción (figura 1).
	<ol>
<li>Diluir lambda DNA usando TE de x 1 a 100 ng / μl. almacenar a 4 ° C. Hacer una solución con un volumen total de 300 μl.</li>
		<li>Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda de la recopilación, estimación de 75-100 ng/banda. Añadir cantidades apropiadas de colorantes para producir concentraciones de 1,9 μm μm 3,8, 19,4 μm, 32.2 μm, μm 48.3, 63.5 μm / 100 ng de ADN.</li>
		<li>Incubar durante una noche (15 h - 18 h) a 4 ° C.</li>
		<li>Dejar uno reacción de la mancha para actuar como un control25. Nota: Use unmethylated DNA por la reacción de digestión. Enzimas sensibles metilación no cortar regiones metiladas en el ADN y le dará un aspecto de una digestión incompleta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación del ensayo enzimático de la restricción
<ol><li>
Resumen de teñido DNA con una enzima de restricción para determinar si esa enzima puede digerir DNA prestained (figura 1).
	<ol>
<li>Al día siguiente, añadir 20 U del enzima de restricción, 3 μl del tampón apropiado (tabla 2) y agua destilado, esterilizado y filtrado para un total de 30 μl. Para cada reacción de la enzima, elegir el tampón con la más alta eficiencia de corte, que se puede encontrar en la web del fabricante.</li>
		<li>Lugar las reacciones en un baño de agua a la temperatura de la actividad enzimática óptima, listado en la tabla 2 para las 6 enzimas utilizadas en Maschmann et al., para 2-4 h (tabla 2)25.</li>
		<li>Detener la reacción agregando 2 μl de pH de EDTA de 0.5 M 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting tinción de DNA en un Gel de agarosa
<ol><li>Desmoldar los lados 24,5 x 21,8 cm gel (paso 1.2.2) y coloque el gel en la caja de la electroforesis de gel. Vierta 2,5 L de tampón de x TAE 1 en el cuadro. Retire cuidadosamente el peine del gel del gel, por lo que los pozos son accesibles33.</li>
	<li>Pipetear las reacciones de la enzima de la restricción en una película de plástico y combinar cada reacción con 6 x carga del tinte. Para cada solución de reacción, añadir 1 μl de 6 x carga colorante por 5 a 6 μl de solución de ADN (1 x). Luego pipetear las reacciones (que contiene el tinte de la carga, < 18 μL) en los pocillos.</li>
	<li>Mezclar 1 μl de escalera de 1 kb, 9 μl de TE 1 x y 2 μl de 6 x carga del tinte. Cargar la solución en los pozos que flanquean las otras soluciones.</li>
	<li>Cubrir el gel caja con tela o papel negro o azul oscuro. Conecte la caja del gel a una fuente de alimentación la fuente de alimentación a 30 V y ejecutar toda la noche (15-20 h). Apague las luces cuando el gel esté funcionando, para evitar fotorrotura de la DNA etiquetada.</li>
	<li>A la mañana siguiente apague la fuente de alimentación. Tomar el gel usando la bandeja y transferir a un envase con 45 bromuro de etidio μl y 1 L de tampón de x TAE 1. Almacenar el envase a temperatura ambiente en la oscuridad o cubierta en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Mancha de gel que por menos de 45 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Utilizar bromuro de etidio con guantes y gafas de seguridad. Al limpiar el contenedor con solución de bromuro de etidio y tirar el gel, consulte sus pautas de disposición de los Estados para determinar cómo tratar con bromuro de etidio utilizado; Además, otras manchas pueden utilizarse en lugar de bromuro de etidio.</li>
</ol>5. la proyección de imagen del Gel de agarosa
<ol><li>Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul, que emite la máxima potencia de luz entre 400-500 nm. Tomar fotos con la cámara acoplada a la estación. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que utilice la cubierta para el iluminador y ponerse gafas de protección antes de encender la fuente de luz. Nota: Este paso puede también completarse usando cualquier fuente de luz UV o el explorador de gel estándar.</li>
	<li>Ver las fotos de ImageJ arrastrando el archivo a la barra de estado de ImageJ y aparecerá la imagen.</li>
	<li>Determinar la tasa de digestión para el experimento comparando las bandas en el gel con el patrón esperado en silico gel. Para determinar la tasa de digestión, el número de bandas experimentales se divide por el número esperado de DNA bandas24,25. Si el patrón de bandas ADN digerido experimental tiene el patrón esperado, la tasa de digestión es 1. Si el patrón tiene fragmentos más de lo esperado, la tasa de digestión es mayor que 1. Si el patrón tiene menos fragmentos de lo esperado, la tasa de digestión es menor que uno.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta20. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que band...

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la familia de dímeros de Cianina es ampliamente utilizada debido a su alta afinidad por las moléculas de ADN18,19,20, rendimiento cuántico y sensibilidad. Colorantes de Cianina dímero tienen gran selectividad para la DNA trenzada doble y cuando se intercalan un aumento de 100 a 1000 veces mayor de fluorescencia21. Tintes de pyridinium (YOYO-1, TOTO-1, 3 YOYO y TOTO-3) tienen una menor longitud de onda emisión de su quinolium del tinte (BOBO-1, 1 POPO, BOBO-3 y POPO 3) contrapartes (tabla 1)22. También, la producción de quántum de dímeros de Cianina intercalada en el ADN es alta (0.2 - 0.6)22. Sin embargo, utilizando una enzima para determinar el perfil de metilación de ADN molécula2 o estiramiento23 de una molécula de ADN ya teñida con colorante fluorescente requiere de un método para determinar qué enzimas digieren DNA manchada. Cualquier tipo de colorante que se intercala en el ADN o cualquier enzima que da un patrón discernible del sustrato de ADN se puede utilizar para este método.
Meng et al. en primer lugar determina la tasa de digestión de prestained ADN mediante electroforesis en gel utilizando una variedad de diferentes tintes24. Maschmann et al. profundizó en más profunda para ver a la familia TOTO de tintes. Ambos determinan la tasa de digestión de DNA manchada para ver si ADN teñida con un colorante determinado podría ser digerido con una enzima de la restricción de25. Otros métodos de estudian efectos vinculantes de tintes intercalados con el ADN usando pinzas ópticas26 o27de NMR. Cualquiera de los métodos requiere de equipo especializado; Considerando que este método permite el equipo que más laboratorios de biología molecular para determinar si un tinte interfiere con una enzima de la restricción digestión.
Además, en otros métodos para medir la longitud de una molécula dada, mapeo óptico ha alargado sin manchas las moléculas de ADN sobre una superficie y digiere ADN para determinar la extensión y tamaño de los fragmentos. Intercalación de tinte se ha demostrado para aumentar la longitud del contorno de las moléculas de ADN fluorescente manchadas y dependiendo del colorante utilizado, los contorno son diferentes21. Este método ha sido utilizado en una variedad de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. sin embargo, si las moléculas previamente teñidas, dependiendo del tinte y la enzima, la enzima puede no poder cortar ADN teñida con un colorante determinado. Por lo tanto, este método determina si ADN teñida con un colorante determinado puede ser digerido con una enzima. Además, dependiendo de la concentración de la tintura y el tinte utilizado, la movilidad de la DNA bandas en un gel migrarán más lentamente que el ADN nativo debido a la corrección parcial de la espina dorsal de la DNA para el tinte insertar entre pares de bases32 .
Sin embargo, a veces estos tintes pueden parcialmente o inhiben totalmente la acción de ciertas enzimas de restricción7,24. Esto es probablemente debido a un cambio estructural en el ADN causado por la fijación del colorante fluorescente, que puede impedir que la enzima reconoce la secuencia específica. Entender cómo estos tintes afectan enzimas de restricción puede ayudar en experimentos donde se requiere el perfil de metilación o el tramo de ADN teñido.
En nuestro método, ADN fue teñido con un fluorocromo de interés y digerido con una enzima de restricción. Luego fue electrophoresed DNA en un gel, reflejado, y se midió la tasa de digestión de la enzima de la restricción. Las enzimas de restricción fueron elegidas basándose en el patrón de corte en un gel. Superposición de bandas de ADN causadas muchas y muy pocas bandas no dio una imagen completa de la molécula de ADN. Hay un punto dulce para poder determinar el perfil de la molécula de ADN digerido; por lo tanto, dependerá de la DNA usada y la enzima. Una ventaja de este método es su simplicidad; sólo requiere equipo usado en una electroforesis de gel y digestión de restricción.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.

Con el fin de determinar que si un colorante intercalante afecta una enzima de restricción que digiere ADN, el orden correcto de pasos debe ser seguidos (figura 1). Una vez que el ADN es manchado y digerido con una enzima dada, una imagen del gel puede tomarse para determinar el número de fragmentos y su tamaño (figura 2). Para determinar la eficiencia de la enzima, el número total de bandas visibles esperados dividido por el...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K vistas.  University of Nebraska - Kearney. Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Investigación

Bioquímica

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genética

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor destacado: Obtener una A con las 3C: Captura de la conformación cromosómica para estudiantes universitarios  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biología

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Estudio de las interacciones de TRF1/2 con el ADN telomérico mediante un ensayo de molécula única

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Técnicas avanzadas de una sola molécula para investigar las interacciones teloméricas proteína-ADN

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Resumen

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Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

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Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

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