Los autores agradecen a Meng Pan para corregir el manuscrito. Este trabajo es apoyado por Singapur Ministerio de educación académica investigación fondo de nivel 3 (MOE2012-T3-1-001) a J.Y.; la Fundación Nacional de investigación a través de la mecanobiología Instituto Singapur J.Y.; la Fundación Nacional de investigación, oficina, Singapur del primer ministro, bajo su programa de Investigatorship de la NRF (NRF Investigatorship premio no. NRF-NRFI2016-03 J.Y.; el fondo de Investigación Fundamental para las universidades Central (2017KFYXJJ153) a H. Y.

me ></ol></li> <li>configuración de la muestra e identificar solo dsDNA tether <ol><li>formación correa <ol><li>suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 200 μL de solución estándar de la reacción. 
			Nota: Los granos de M-280 muestran menor fijación no específica a la superficie en comparación con otros granos magnéticos comerciales como M-270.</li>
		</ol></li> <li>Instale el canal en la platina del microscopio. La búsqueda para los granos en la superficie inferior con el 100 X objetivo de inmersión de aceite.</li>
		<li>Seleccionar una cuenta de referencia en la superficie y un cordón atado movimiento. Construir las bibliotecas de la imagen inicial del grano referencia y grano anclado en planos diferentes desenfoque.</li>
		<li>Calibración de imagen de granos <ol><li>antes de los experimentos, utilizar un actuador piezoeléctrico objetiva para obtener imágenes de referencia y granos anclados en desenfocar diferentes planos espaciados por 20-50 nm, que se almacenan como dos imágenes separadas del grano bibliotecas y son indexadas respectivamente con la distancia del desenfoque ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>x, y, determinación de la posición de z <ol><li>durante los experimentos, determinan la posición del grano en el plano x-y por el centroide de grano. Determinar el cambio de altura de los talones atado mediante la comparación de la imagen actual del grano con los almacenados en la biblioteca. Utilizar el análisis de la función de auto correlación del espectro de energía de la transformada de Fourier del grano imágenes 16.</li>
		</ol></li> <li>Anti deriva retroalimentación utilizando grano de referencia <ol><li>durante los experimentos, utilizar el piezo a &#34; bloqueo &#34; la distancia entre el objetivo y una imagen de referencia específica del grano almacenado en la biblioteca a través de una baja frecuencia control de retroalimentación, para que la imagen del grano pegado tiene la mejor correlación con una específica imagen almacenada en la biblioteca ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>Determinar si el anclaje es una molécula única dsDNA mediante la aplicación de ~ 65 pN fuerza determinar una molécula dsDNA solo si el anclaje somete el ADN característica estirar demasiado transición 17 , 18 , 19. Repita el proceso hasta encontrar un anclaje de dsDNA sola. (Consulte la sección siguiente para la calibración de fuerza y ADN estirar demasiado la transición).</li>
	</ol></li></ol> 4. Calibración de fuerza de pinza magnética <ol><li>determinar directamente la fuerza (hasta 100 pN) por largo (48.502 bp ADN λ) las moléculas de ADN con fluctuación de grano a través de: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , donde k B es la constante de Boltzmann, T es la temperatura en escala Kelvin, δ 2 y es la varianza de la fluctuación de grano en la dirección perpendicular al campo magnético y la fuerza Dirección. En este sentido, el movimiento del grano puede ser descrito como una fluctuación de péndulo con una longitud de l + r 0, donde l es la distancia de extremo a extremo a lo largo de la dirección de la fuerza (extensión) de la DNA, y r 0 el radio del grano 10 ( Figura 3A).</li>
	<li>Determine la curva de calibración para la fuerza F en función de los imanes a la distancia del grano d y F (d) para distintos granos usando la DNA de λ larga. La distancia entre el imán y el cubreobjetos se utiliza generalmente, como la longitud de anclaje de ADN puede ser ignorada. Ajuste F-d curva de la función del decaimiento exponencial doble: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , donde la conexión parámetros α1, α2, γ1, γ2 son determinados por la pinzas magnéticas y el parámetro C es determinado por la propiedad heterogénea de las bolas magnéticas. Cambiando la C, F-d curva obtenida de diversos granos puede ser traslapado 10 ( figura 3B).</li>
	<li>Experimentos de calibración del parámetro C para granos magnéticos individuales de ADN corto.
	<ol><li>Determinación de la fuerza basada en la fluctuación requiere grabar la posición del grano en una frecuencia más alta que la frecuencia esquina: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , donde γ es el arrastre coeficiente de la cuenta. Para DNA corto en alta fuerza, requiere grabación de frecuencia superior a 100 Hz, por lo tanto, la fuerza no puede ser directamente medida en base a la fluctuación con la cámara. Sin embargo, el parámetro C se puede determinar midiendo la fuerza en un mínimo fuerza gama (&#60; pN 15) con fluctuación y guarnición de los datos con un calibrado F-d curva para obtener el parámetro C 20.</li>
		<li>De forma alternativa, para experimentos con el dsDNA, determinar el parámetro C usando la DNA estirar demasiado la transición a una fuerza de ~ 65 pN ( figura 3) 21 , 22 , 23 mediante el registro de la posición d en que salto de extensión demostró dsDNA (0,6 X aumento de la longitud de la longitud del contorno). Después de determinar el parámetro C, calcular la fuerza de los granos atados.</li>
	</ol></li> <li>Control de la velocidad de carga mediante la programación del movimiento de los imanes a través de la función inversa de F (d). El imán debe acercar la muestra doble exponencial. 
	Nota: El error relativo de la fuerza determinado por un método de extrapolación es ~ 10% y es causada principalmente por el grano radio heterogeneidad 20.</li>
</ol> 5. Manipulación de una sola molécula de G4 en la presencia y la ausencia de proteínas vinculantes <ol><li>fuerza-rampa experimentos <ol><li>después de identificar el anclaje de dsDNA, realizar un análisis de aumento de la fuerza a una velocidad de carga de 0,2 pN/s seguido por un exploración de la fuerza-fallecimiento en -0.2 pN/s. Después de cada ciclo de estiramiento, mantenga la molécula de ADN en 1 pN 30 s para permitir el ssDNA replegar a G4.</li>
	</ol></li> <li>Experimentos de fuerza de salto <ol><li>ciclo de la fuerza entre 54 pN 30 s en las que un G4 doblado podría ser desplegado y 1 pN para los años 60, bajo las cuales podría replegar un G4-15T doblado.</li>
	</ol></li> <li>Solución de flujo de proteína <ol><li>flujo de la solución de proteína cuando en ~ 20 pN fuerza para evitar la fijación de los granos el cubreobjetos. La helicasa RHAU DEAH-box, que demostraron alta especificidad a la estructura G4, fue usado 24. La recombinante helicase RHAU (DmRHAU) de Drosophila melanogaster fue expresada en Escherichia coli y purificada como se describió anteriormente 25. El G4 desenrollar actividad de DmRHAU se analiza en un tetramolecular G4 ADN sustrato 13.</li>
	</ol></li> <li>Analizar la fuerza de despliegue con un interno escrito Matlab programa 14.</li></ol>

<ol>
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C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA.">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces.">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li><li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation.">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li><li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis.">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li><li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension.">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li><li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. 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S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA.">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. 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U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Vaughn, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Como se describió anteriormente, una plataforma para el estudio de la estabilidad mecánica de la DNA de G4 y las interacciones de la proteína a G4 usando pinzas magnéticas de una sola molécula se divulgan. Acompañando a la plataforma, se desarrollan protocolos eficientes de encontrar anclaje G4 ADN y medición de la dinámica de plegar-desplegar y la estabilidad de la estructura G4 con resolución especial nanómetros. La fijación del plano focal permite control antideriva altamente estable, que es importante para...

Trenzado de cuatro estructuras de ADN o ARN G4 desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos importantes1. Muchas proteínas están implicadas en el enlace de G4 y regulación, incluyendo proteínas telomere (telomerasa, TRF2, POT1, RPA, TEBPs)1,2, factores de transcripción (nucleolin PARP1)3, RNA, proteínas (hnRNP A1, de procesamiento hnRNP A2)4, helicasas (BLM FANCJ RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5y replicación del ADN relacionadas con proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Unión a proteínas puede estabilizar o desestabilizar las estructuras G4; así regular las funciones biológicas posteriores. La estabilidad del G4 se midió por termo fusión usando radiación ultravioleta (UV) o métodos de dicroísmo circular (CD)7. Sin embargo, tales condiciones no son fisiológicos relevantes y son difíciles de aplicar al estudio de los efectos de la Unión de proteínas7.
El rápido desarrollo de tecnologías de manipulación de una sola molécula ha permitido estudios de plegar y desplegar de una biomolécula, como ADN o una proteína, a nivel de una sola molécula con resolución nanométrica en tiempo real8. Microscopía de fuerza atómica (AFM), pinzas ópticas y pinzas magnéticas son los más utilizados métodos de manipulación de una sola molécula. En comparación con AFM y pinza óptica9, pinzas magnéticas permiten mediciones estables de plegar-desplegar dinámicas de una sola molécula durante días utilizando una técnica anti deriva10,11.
Aquí, una plataforma de manipulación de una sola molécula con pinzas magnéticas para estudiar la regulación de la estabilidad de la G4 de las proteínas es divulgado12,13. Este trabajo describe los métodos básicos, incluyendo preparación de muestra y el flujo de canal, la instalación de pinzas magnéticas y la calibración de fuerza. Permiten el control de la fuerza y los protocolos anti deriva como se describe en el paso 3 para largo tiempo las mediciones con varios controles de la fuerza, como fuerza constante (fuerza de sujeción) y constante carga tarifa (fuerza-rampa) y medición de salto de fuerza. El protocolo de calibración de fuerza se describe en el paso 4 permite calibración de fuerza de &#60; correas cortas 1 μm sobre una fuerza amplia gama pN hasta 100, con un error relativo dentro del 10%. Un ejemplo de regulación de la estabilidad de la helicasa de ARN asociada a helicase de elemento (RHAU) ricos en AU (alias DHX36, G4R1) que juega un papel esencial en la solución de que RNA G4 se utiliza para demostrar las aplicaciones de esta plataforma13.

<table><tbody><tr><td>DNA PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>DNA PCR chemicals</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>restriction enzyme BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td><td>BMH.BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Olympus Microscopes IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>CCD/CMOS camera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Translation linear stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Cubic Magnets</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Data analysis</td></tr></tbody></table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

Estructura secundaria de ácidos nucleicos no canónicos que g-quadruplexes (G4) intervienen en diversos procesos celulares, tales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento de RNA y alargamiento de los telómeros. Durante estos procesos, varias proteínas se unen y resolución estructuras G4 para realizar su función. Como la función de G4 a menudo depende de la estabilidad de su estructura doblada, es importante investigar cómo G4 proteínas regulan la estabilidad del G4. Este trabajo presenta un método para manipular las moléculas individuales de G4 con pinzas magnéticas, que permite estudios de la regulación de proteínas G4 en una sola molécula G4 en tiempo real. En general, este método es conveniente para una amplia gama de aplicaciones en estudios de interacciones de proteínas/ligandos y las regulaciones sobre varias estructuras secundarias DNA o RNA.

El montaje experimental para estirar una sola molécula G4 se muestra en la figura 4. Una secuencia de formación de G4 de monocatenario atravesada entre dos asas del dsDNA fue anclada entre un cubreobjetos y un talón paramagnético. Para encontrar una tira atada solo dsDNA, se realizó un ensayo demasiado incrementando la fuerza en las tasas de carga constante. A menudo se utilizaron tres tipos de mediciones para estudiar el plegamiento y desplegamiento de ...

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K vistas.  Huazhong University of Science and Technology. Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

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A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Investigación

Bioquímica

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Bioingeniería

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Identificación de g-cuádruples en una plantilla de ADN mediante mapeo químico

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor destacado: Caracterización del ADN G-Quadruplex mediante mapeo químico basado en bis-3-cloropiperidina 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Resumen

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Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas