Die Autoren danken Meng Pan für Korrekturlesen Manuskript. Diese Arbeit wird von Singapur Ministerium der Ausbildung akademische Forschung Fonds Stufe 3 (MOE2012-T3-1-001), J.Y unterstützt; der National Research Foundation über das Mechanobiology Institut Singapur, J.Y; der National Research Foundation, des Premierministers Büro, Singapur, unter seinem NRF Investigatorship Programm (NRF Investigatorship Award Nr. 03 / NRFI2016 / NRF, J.Y; die Grundlagenforschung Fonds für den Central-Universitäten (2017KFYXJJ153), H. Y.

1. Vorbereitung der G4 DNA Einzelmolekül-Stretching <ol><li>Prepare 5 &#39;-Thiol beschriftet und 5 &#39;-Biotin beschriftet DsDNA Griffe durch PCR mit DDNA Polymerase auf einen Lambda-Phagen DNA Schablone mit 5 &#39;-Thiol und 5 &#39;-Biotin Primer 14 ( Abbildung 1). Beide DsDNA-Griffe haben hohen GC-Gehalt (&#62; 60 %), um DNA zu verhindern schmelzen wenn DNA zu hohen Kräften oder während DNA Überdehnung stattfindet Übergang 15.</li>
	<li>Reinigen PCR-Produkte mit BstXI Restriktionsenzym laut Hersteller eine kommerzielle Reinigung Kit und verdauen &#39; s Protokoll.</li>
	<li>Verbinden G4 bilden SsDNA und Flanke SsDNA und DsDNA Griffe mit T4 DNA-Ligase laut Hersteller &#39; s-Protokoll. Die aufgespaltenen Produkt durch Gel-Extraktion mithilfe eines gewerblichen Reinigung-Kits nach Angaben des Herstellers zu reinigen &#39; s Protokoll.</li>
</ol> 2. Vorbereitung des Strömungskanals <ol><li>Deckglas Reinigung und Oberflächen Funktionalisierung <ol><li>Ort unten Deckgläsern (#1.5, 22 mm × 32 mm) und oberen Deckgläsern (#1.5, 20 x 20 mm) in Abdeckung Glas Gläser (jedes Glas fasst 7 Stück Deckgläsern, Färbung das Volumen beträgt ~ 20 mL). Spülen Sie die Deckgläsern in den Gläsern mit destilliertem Wasser 2-5 Mal.</li>
		<li>Add ~ 20 mL Reinigungslösung 5-40 % in jedes Glas und legen Sie dann in ein Ultraschall Reinigungsbad für 30 min. Spülen mit destilliertem Wasser für &#62; 10 Mal um die Reinigungsmittel zu entfernen.</li>
		<li>Deckgläsern in die Gläser im Ofen trocknen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß), oder durch N 2 Gas. Speichern Sie die getrockneten Top Deckgläsern in einem Trockenschrank.</li>
		<li>Einsatz Plasma (O 2 Gas) zu die Deckgläsern in der Dose für 10 min reinigen. Bereiten Sie während 10 min, 20 mL von 1 % (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) Lösung in Methanol (Vorsicht, giftig/entzündlich). Verwenden eine chemischen Dampfhaube APTES Methanol auflösen. 
		Hinweis: Vermeiden Sie Feuchtigkeit bei der Lagerung APTES Lösung. Alten APTES verursacht oft Problem in Oberfläche Funktionalisierung von Deckgläsern.</li>
		<li>Unmittelbar nach dem Plasma Reinigung, fügen Sie alle die 1 % APTES Lösung in die Gläser und inkubieren Sie für 1 h. Gießen Sie den Abfall in die Abfallflasche spezifisch für 1 % APTES Methanol. Führen Sie die Schritte im Zusammenhang mit Methanol in der Dunstabzugshaube für brennbare Chemikalien.</li>
		<li>Spülen Sie die Gläser einmal mit Methanol und &#62; 10 Mal mit destilliertem Wasser und dann trocknen von Ofen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß). Speichern der APTES-beschichtete Unterseite Deckgläsern für bis zu zwei Wochen bei Nichtgebrauch in einem Trockenschrank. 
		Hinweis: Nach jedem Teilschritt aus 2.1.1 bis 2.1.4 der Reinigungsprozess kann angehalten werden vor dem nächsten Schritt.</li>
	</ol></li> <li>Montage des Strömungskanals <ol><li>bereiten Sie zwei &#34; Abstandshalter &#34;, d.h., Parafilm oder doppelseitige Klebeband (~ 4 mm × 20 mm) für jeden Kanal. Legen Sie die zwei Stücke von Abstandhaltern auf einem unteren Deckgläschen entlang der langen Kante. Das Distanzstück, bilden eine Durchflusszelle dazwischen ein Top Deckglas auflegen (~ 10 mm × 20 mm Bereich, Figur 2A , B).</li>
		<li>Wenn Parafilm als Abstandhalter dient, platzieren Sie den Strömungskanal auf eine Heizung (60-120 ° C; Vorsicht, heiß) für 5-10 s drücken Sie sanft die Seiten des oberen Deckglas zwei Deckgläsern mit Parafilm zusammenhalten. Die resultierende Flow-Kanal hat eine Höhe von ~ 100 µm und damit das Volumen des Kanals beträgt ~ 20 µL.</li>
		<li>Dichtung die lange Kante des Kanals mit Silikonkleber um Leckagen zu vermeiden. Silikonkleber verwenden, um eine kleine Senke-ähnliche Struktur auf jede offene Kante des Strömungskanals, dient als ein Eingang und ein Ausgang der Lösung machen. 
		Hinweis: Die ein- und Ausreise können auch erfolgen durch andere Wege, z.B. durch anhaftenden kleinen Kunststoff-Ringe mit Wachs.</li>
		<li>Speichern von Sendern in einem Trockenschrank für bis zu 4 Wochen.</li>
	</ol></li> <li>Leine DNA auf der unteren Fläche des Strömungskanals <ol><li>verdünnen die amino-beschichtete Polystyrol-Kügelchen (Durchmesser: 3 µm) von 200 X in destilliertem 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer. Wirbel die Wulst-Lösung und dann in Kanäle fließen. Inkubieren Sie die Wulst-Lösung in Kanälen für ~ 30 min. Entfernen jede ablösen Perlen durch Waschen mit 200 µL 1 X PBS-Puffer.</li>
		<li>Anpassen (Zunahme/Abnahme) der Inkubationszeit einer Flächendichte von 1 bis 5 Perlen pro 50 mm x 50 mm-Bereich zu erreichen. Speichern Sie die Kanäle, hinterlegt mit den Referenz-Perlen für bis zu 3 Tage.</li>
		<li>Verdünnt Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) Pulver in 1 X PBS-Lösung (~ 0,5 mg/mL). Vortex die Lösung und dann in den Kanal fließen. 
		Hinweis: Bereiten Sie frische Sulfo-SMCC-Lösung vor Gebrauch und den Kanal, Hydrolyse des SMCC zu vermeiden sofort hinzufügen.</li>
		<li>Inkubation die SMCC-Lösung in den Kanal für 30 min. Entfernen Sie die SMCC-Lösung durch Waschen mit einer großen Menge (1 mL ~ 50 X die Lautstärke des Kanals) 1 X PBS-Lösung. 
		Hinweis: Waschen Sie die überschüssige SMCC sorgfältig. Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Bindung von DNA auf das Deckglas.</li>
		<li><ol><li>DNA Anbindehaltung Verdünnen der Thiol-Biotin gekennzeichnet DNA in 1 X PBS, mit einer daraus resultierenden DNA-Konzentration von ~ 0,3 nM. Pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung, die DNA-Lösung in die SMCC-beschichtete Kanal fließen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Vorsichtig Waschen entfernt freien DNA mit 200 µL des Blockierens Projektmappe mit 1 X PBS mit 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01 % 2-Mercaptoethanol.</li>
		<li>Blockieren die Kanal-Oberfläche durch Inkubation des Kanals in blocking-Lösung (10 mg/mL BSA, 0,01 % 2-Mercaptoethanol) für &#62; 2 h; nach diesem Schritt, der Kanal ist bereit für Experimente. Die vorbereitete Kanal bei 4 ° C gehalten werden kann ~ 1 Tag. 
		Hinweis: Die Blockierungsschritt ist wichtig zur Reduzierung der unspezifischen Bindung von DNA und magnetische Beads zu den Deckgläsern.</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnetischen Pinzette Setup und Identifizierung der einzelnen DsDNA Tether <ol><li>magnetischen Pinzette Setup <ol><li>Start der magnetischen Pinzette Steuern Programm. Hier die magnetischen Pinzette durch eine in-house-geschrieben LabVIEW-Programm gesteuert wurden.</li>
		<li>Richten Sie die Magnet-Zentren vor der Montage des Kanals. Ein 4 X Objektiv verwenden, um die X - und y-Achse die Magnete in der optischen Achse des Mikroskops anzupassen.</li>
		<li>Verwenden einen computergesteuerte motorisierte Manipulator zu bewegen die Magneten entlang der Z-Richtung ( Abb. 2A) und legen Sie den Abstand d = 0 (d: Abstand zwischen den Magneten und Deckglas) wenn die Magnete befestigen Ein Deckglas am Mikroskop.</li>
		<li>Programm der Bewegung des Magneten durch den Manipulator, Kontrolle von Gewalt, einschließlich konstanten Kraft (d.h., Konstante d) zu erreichen und unterschiedliche Zeit Kraft F (t) (d.h. Zeit unterschiedliche d(t )).</li>
		<li>Verwenden helle Lichtquelle Light Emitting Diode (LED) für zurückgestreute Beleuchtung des Wulstes durch das Ziel. Die Perle-Bilder bei einer Abtastrate von 100 Hz zu sammeln, indem Sie ein Ladegerät – gekoppelt (CCD) Kamera. < / lIch ></ol></li> <li>Probieren Sie Setup und identifizieren einzelne DsDNA Leine <ol><li>Leine Bildung <ol><li>sanft fließen in 200 X verdünnt M-280, paramagnetische Perlen in Assay-Lösung (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) in einen Kanal. Inkubieren Sie für 10 min bis die Perlen an Biotin-markierten DNA-Moleküle auf der SMCC-beschichtete Oberfläche durch Thiol-Label Ende immobilisiert binden zu lassen. Vorsichtig Waschen entfernt un-gefesselte Perlen mit 200 µL standard Reaktionslösung. 
			Hinweis: Der M-280 Perlen zeigen geringere unspezifische Bindung an die Oberfläche im Vergleich zu anderen kommerziellen magnetische Beads wie M-270.</li>
		</ol></li> <li>Montieren Sie den Kanal auf den Mikroskoptisch. Suche nach den Perlen auf der Bodenfläche mit 100 X Öl Immersion Ziel.</li>
		<li>Wählen Sie eine Referenz-Perle auf der Oberfläche und eine bewegliche gefesselte Perle. Die Anfangsbild Bibliotheken der Referenz Wulst und gefesselte Wulst an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge zu bauen.</li>
		<li>Kalibrierung des Perlen-Bildes <ol><li>vor Experimenten, verwenden Sie eine objektive Piezoaktor erhalten Sie Bilder von Referenz und gefesselte Perlen an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge Abstand von 20-50 nm, die als zwei separate Wulst Bild gespeichert werden Bibliotheken und sind jeweils mit der Unschärfe-Abstand ( Abb. 2D) indexiert.</li>
		</ol></li> <li>X, y, Z Positionsbestimmung <ol><li>während der Experimente, bestimmen die Position der Schweißnaht in der X-y-Ebene durch die Wulst-Schwerpunkt. Bestimmen Sie die Höhenänderung des tethered Wulstes durch den Vergleich des aktuellen Bildes Wulst mit denen in der Bibliothek gespeichert. Verwenden Sie die Auto-Funktion Korrelationsanalyse der Leistungsspektrum der Fourier-Transformation der Wulst Bilder 16.</li>
		</ol></li> <li>Anti-Drift-Feedback über Referenz Perle <ol><li>während der Experimente, verwenden die Piezo, &#34; Schloss &#34; den Abstand zwischen dem Ziel und spezifische Referenz Wulst Bild in der Bibliothek durch eine niedrige Frequenz gespeichert Feedback zu steuern, so dass das Bild stecken Perle die beste Korrelation mit einem bestimmten Bild in der Bibliothek ( Bild 2D) gespeichert hat.</li>
		</ol></li> <li>Festzustellen, ob die Leine durch die Anwendung einer einzigen DsDNA-Molekül ist ~ 65 pN Kraft eines einzigen DsDNA-Molekül zu bestimmen, wenn die Leine durchläuft die charakteristischen DNA Überdehnung Übergang 17 , 18 , 19. Wiederholen Sie den Vorgang, bis ein einzelnes DsDNA-Tether gefunden wird. (Siehe den nächsten Abschnitt Kraft Kalibrierung und DNA Überdehnung Übergang).</li>
	</ol></li></ol> 4. Magnetischen Pinzette zwingen Kalibrierung <ol><li>bestimmen direkt die Kraft (bis zu 100 pN) für lange DNA (48.502 bp λ-DNA) Moleküle mit Wulst Fluktuation durch: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , wobei k B ist die Boltzmann-Konstante, T ist die Temperatur in Kelvin-Skala, δ 2 y ist die Varianz der Wulst Fluktuation in der Richtung senkrecht zu dem Magnetfeld und die Kraft Richtung. In diese Richtung kann die Bewegung des Wulstes beschrieben werden als ein Pendel Fluktuation mit einer Länge von l + R 0, wo l ist die End-to-End Abstand entlang der Kraftrichtung (Verlängerung) der DNA, und R 0 ist der Radius der Perle 10 ( Abb. 3A).</li>
	<li>Bestimmen die Eichkurve für Kraft F als Funktion der Magnete zu Wulst Abstand d und F (d) für verschiedene Perlen mit der langen λ-DNA. In der Regel wird der Abstand zwischen Magnet und das Deckglas verwendet, wie die DNA-Tether Länge ignoriert werden kann. Passen die F-d-Kurve von der doppelten exponentiellen Zerfall-Funktion: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , wo die passenden Parameter α1, α2, γ1, γ2 richten sich nach der magnetischen Pinzette und der Parameter C wird durch die heterogene Eigenschaft der magnetischen Beads bestimmt. Durch die Verlagerung der C, F-d-Kurve aus verschiedenen Perlen gewonnen werden kann überlappende 10 ( Abb. 3 b).</li>
	<li>Kalibrierung der Parameter C für die einzelnen magnetischen Kügelchen für kurze DNA experimentiert.
	<ol><li>Bestimmung der Kraft, die anhand der Fluktuation erfordert Aufzeichnung der Wulst-Position mit einer Frequenz höher als die Grenzfrequenz: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , wobei γ ist die Drag Koeffizient der Wulst. Für kurze DNA bei hoher Krafteinwirkung es erfordert Aufnahmefrequenz schneller als 100 Hz, also die Kraft kann nicht direkt gemessen werden basierend auf Schwankungen mit der Kamera. Allerdings zwingen der Parameter C ermittelt werden, durch die Messung der Kraft auf einem niedrigen Bereich (&#60; 15 pN) mit Fluktuation und Anpassung der Daten mit einem kalibrierten F-d-Kurve zu den Parameter C 20.</li>
		<li>Alternativ für Experimente mit DsDNA, festlegen den Parameter C mit DNA Überdehnung Übergang bei einer Kraft von ~ 65 pN ( Abbildung 3) 21 , 22 , 23 durch die Aufnahme der d-Position an die DsDNA zeigte Erweiterung Sprung (0,6 X Längenzunahme der Kontur Länge). Nach der Festlegung des Parameters C, berechnen die Kraft für die gefesselten Perlen.</li>
	</ol></li> <li>Steuern die Raumbelastung durch die Programmierung der Bewegung des Magneten durch die Umkehrfunktion von F (d). Der Magnet sollte die Probe doppelt exponentiell nähern. 
	Hinweis: Ist der relative Fehler der Kraft, die durch solch eine Hochrechnung Methode bestimmt ~ 10 % und wird hauptsächlich durch die Perle Radius Heterogenität 20.</li>
</ol> 5. Einzelmolekül-Manipulation der G4 in Anwesenheit und Abwesenheit der verbindlichen Proteine <ol><li><ol><li>Kraft-Rampe experimentiert, nach der Identifizierung der DsDNA-Leine, führen Sie einen Kraftanstieg Scan auf eine Besatzrate von 0,2 pN/s gefolgt von einem Kraft-Ableben Scan auf -0,2 pN/s. Nach jedem stretching Zyklus halten das DNA-Molekül in 1 pN für 30 s erlauben die SsDNA zu G4 umfalten.</li>
	</ol></li> <li>Kraft-Sprung Experimente <ol><li>Zyklus der Gewalt zwischen 54 pN für 30 s, unter denen eine gefaltete G4 entfaltet werden könnte, und 1 pN für 60 s, unter denen eine gefaltete G4-15 t entfalten könnte.</li>
	</ol></li> <li>Fließende Proteinlösung <ol><li>fließen die Proteinlösung bei ~ 20 pN Kraft zur Befestigung der die Perlen auf dem Deckglas zu vermeiden. DEAH-Box RHAU Helikase, die hohen Spezifität der G4-Struktur zeigte, war verwendeten 24. Die rekombinante Drosophila Melanogaster RHAU (DmRHAU) Helikase wurde in Escherichia coli ausgedrückt und gereinigt wie zuvor beschrieben 25. Die G4 abwickeln Tätigkeit des DmRHAU auf ein Tetramolecular G4-DNA Substrat 13 untersucht wurde.</li>
	</ol></li> <li>Analysieren die sich entfaltenden Kraft mit einer hauseigenen geschrieben Matlab Programm 14.</li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+magnetic+tweezers.">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li><li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters:+a+novel+anticancer+strategy?.">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li><li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders:+Synthesis,+Biophysical,+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives.">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li><li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-B+DNA+conformations,+mutagenesis+and+disease.">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einzelmolekül-magnetischen Pinzette wird berichtet, wie beschrieben, eine Plattform für die Untersuchung der mechanischen Stabilität der G4-DNA und die Interaktionen von Proteinen mit G4. Begleiten die Plattform, sind hocheffiziente Protokolle zu finden, G4-DNA Haltegurt und Messung der Faltung entfaltet Dynamik und Stabilität der G4-Struktur mit Nanometer Sonderbeschluss entwickelt. Die Brennebene Verriegelung ermöglicht hochstabile Anti-Drift-Steuerelement, das ist wichtig für die Erkennung eines kleinen Struktur...

Vier-Stranded DNA oder RNA G4 Strukturen spielen wichtige Rollen in viele wichtige biologische Prozesse1. Viele Proteine beteiligt sind G4 Bindung und Verordnung, einschließlich der Telomer-bindende Proteine (Telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, Transkriptionsfaktoren (Nucleolin, PARP1)3, RNA, Proteine (HnRNP A1, Verarbeitung HnRNP A2)4, Helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5und DNA-Replikation im Zusammenhang mit Proteinen (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindung kann stabilisieren oder destabilisieren G4 Strukturen; so regelt die nachfolgende biologische Funktionen. Die Stabilität des G4 wurde durch thermische schmelzen mit Ultraviolett (UV) oder kreisförmigen Dichroismus (CD) Methoden7gemessen. Solche Bedingungen sind jedoch nicht physiologischen relevant und sind schwierig, die Auswirkungen der verbindlichen Proteine7anzuwenden.
Die rasante Entwicklung im Einzelmolekül-Manipulation Technologien hat Studien von Falten und entfalten von ein Biomolekül, wie eine DNA oder ein Protein Einzelmolekül-Ebene mit Nanometer-Auflösung in Echtzeit8aktiviert. Rasterkraftmikroskopie (AFM), optische Pinzette und magnetischen Pinzette sind die am häufigsten verwendeten Methoden der Einzelmolekül-Manipulation. Im Vergleich zu AFM und optische Pinzette9, ermöglichen magnetischen Pinzette stabile Messungen der Faltung entfaltet Dynamik eines einzelnen Moleküls über Tage mithilfe einer Anti-Drift-Technik10,11.
Hier ist eine Einzelmolekül-Manipulation-Plattform magnetischen Pinzette, um die Regulierung der G4 Stabilität zu studieren, durch die Bindung von Proteinen gemeldeten12,13. Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Ansätze, einschließlich Probe und Flow-Kanal-Vorbereitung, das Setup der magnetischen Pinzette und die Kraft-Kalibrierung. Die Kraftregelung und die Anti-Drift-Protokolle wie beschrieben in Schritt 3 ermöglichen lange Zeitmessungen unter verschiedenen Kraft Steuerelemente, z. B. konstante Kraft (Kraft Klemme) und konstante laden bewerten (Kraft-Rampe) und Kraft-Sprung Messung. Das Kraft-Kalibrierung-Protokoll in Schritt 4 beschriebenen ermöglicht Kraft Kalibrierung des &#60; 1 µm kurze Anbindehaltung über eine große Kraft reichen bis zu 100 pN, mit einem relativen Fehler innerhalb von 10 %. Ein Beispiel für eine Regulierung der Stabilität der RNA-Helikase zugeordnete AU-reiche Element (RHAU) Helikase (Alias DHX36, G4R1), der spielt entscheidende Rolle bei der Lösung, dass RNA G4 verwendet wird, um die Anwendungen von dieser Plattform13demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>DNA PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>DNA PCR chemicals</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>restriction enzyme BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td><td>BMH.BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Olympus Microscopes IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>CCD/CMOS camera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Translation linear stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Cubic Magnets</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Data analysis</td></tr></tbody></table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

Nicht-kanonische Nukleinsäure-Sekundärstruktur, die G-Quadruplexe (G4) in verschiedenen zellulären Prozessen, wie DNA-Replikation, Transkription, RNS-Verarbeitung und Telomere Dehnung beteiligt sind. Während dieser Prozesse verschiedener Proteine binden und lösen G4 Strukturen, ihre Funktion auszuführen. Da die Funktion des G4 oft auf die Stabilität der gefaltete Struktur abhängt, ist es wichtig zu untersuchen, wie G4-bindende Proteine regulieren die Stabilität des G4. Dieses Werk stellt eine Methode zum manipulieren G4 Einzelmoleküle magnetischen Pinzette, die Studien über die Regulierung der G4-bindende Proteine auf ein einzelnes Molekül der G4 in Echtzeit ermöglicht. Im Allgemeinen ist diese Methode geeignet für ein breites Spektrum von Anwendungen in Studien für Proteine/Liganden Interaktionen und Vorschriften auf verschiedenen DNA- oder RNA-Sekundärstrukturen.

Die Testeinrichtung für die Dehnung eines einzelnen Moleküls G4 ist in Abbildung 4dargestellt. Eine einsträngige G4 bildende Sequenz erstreckte sich zwischen zwei DsDNA Griffe war zwischen einem Deckgläschen und einem paramagnetischen Perle angebunden. Um eine einzelne DsDNA gefesselte Perle zu finden, wurde ein overstretching Assay durchgeführt, durch die Erhöhung der Kraft bei konstanter Belastung. Drei Arten von Messungen dienten oft zur Untersuchung...

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Aufrufe.  Huazhong University of Science and Technology. Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Serie: Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Biotechnik

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Magnetische Pinzette im Mikroplattenformat

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Magnetische Pinzette im Mikroplattenformat

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Identifizierung von G-Quadruplexen in einer DNA-Vorlage mittels chemischer Kartierung

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung von DNA-G-Quadruplex durch Bis-3-Chloropiperidin-basiertes chemisches Mapping 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

Magnetische Pinzette im Mikroplattenformat

Magnetische Pinzette im Mikroplattenformat

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine