Los autores no tienen nada que revelar.

1. preparar el medio de crecimiento Nota: la composición química de M63 medio mínimo es el siguiente: 62 m m K 2 HPO 4, 39 m m KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 μm FeSO 4, 15 μm tiamina-HCl, 0,2 mM MgSO 4 y 22 mM de glucosa. M63 se hace mezclando tres soluciones: solución X 5, 20% de glucosa y solución de MgSO 4 tiamina. Almacene todas las soluciones a 4 ° C.
<ol><li>Preparación de la solución de X 5 <ol><li>para preparar solución de FeSO 4, utilice una pipeta eléctrica y una pipeta serológica desechable para agregar ddH 2 O a un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilizar un P-200 Añadir 0,06 mL de HCl para obtener 36 mg FeSO 4 0.01 M HCl. Añadir-7 H 2 O y mezcle bien.</li>
		<li>Medir 160 mL ddH 2 O en una probeta y añadir un vaso de precipitados de 500 mL. Agregue lo siguiente en este orden: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g de (NH 4) 2 SO 4 y 0,5 mL de solución de FeSO 4 (preparado en el paso 1.1.1).</li>
		<li>Usando un medidor de pH de precisión, ajustar el pH a 7.0 agregando 2 M KOH. Vierta la solución en una probeta y añadir ddH 2 O a un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución utilizando una unidad de filtración de 250 mL (PVDF, 0,22 μm).</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la solución de glucosa 20% <ol><li>medir 200 mL ddH 2 O en una probeta y verter un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 50 g de glucosa. Diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 250 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la solución de MgSO 4 tiamina <ol><li>añadir 150 mL ddH 2 O un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 1,0 g de tiamina-HCl y 10 g de MgSO 4-7 H 2 O. diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparación mínima M63 medio <ol><li>Coloque la solución de X 5, la solución de glucosa 20%, la solución de MgSO 4 tiamina, una pipeta electrónica, una pipeta P-200 y puntas de pipeta de 200 μL en un banco limpio.</li>
		<li>ML 155,8 ddH 2 O en una probeta y verter en un vaso de precipitados de 500 mL.</li>
		<li>Usando la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable, agregar 40 mL de solución de 5 X y solución glucosa al de 20% 4 mL con el ddH medido 2 O. Luego, agregar 0,2 mL de solución de MgSO 4 tiamina con la P-200. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparar el caldo glicerol cultura <ol><li>celular Nota: las cepas bacterianas (p. ej., W3110 y sus genomas reducidos) están disponibles de organizaciones Banco de tensión. Las cepas se obtienen generalmente en forma de colonias en placas de agar.
	<ol><li>Colocar cinco tubos de cristal esterilizado con tapones de goma de silicona, una pipeta electrónica, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μl y las cepas target (colonias en las placas) en un banco limpio.</li>
		<li>Exponga la boca del tubo de vidrio con un mechero de Bunsen antes de abrir el tapón de goma de silicona. Exponer el tapón de goma de silicona para la llama después de que se abre el tubo y luego ligeramente Coloque la tapa en el tubo de cristal.</li>
		<li>Utilice la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable para añadir a uno de los tubos de vidrio y 4,5 mL M63 a los otros cuatro tubos 5 mL M63.</li>
		<li>Utilice la punta del P-200 una colonia y inocular en el tubo de vidrio que contiene 5 mL M63.</li>
		<li>El tubo de vórtice para hacer una suspensión. Entonces, la solución diluida 10 veces al transferir 0,5 mL de esta solución a uno de los cuatro tubos conteniendo 4,5 mL M63.</li>
		<li>Repetir el proceso descrito en el paso 2.1.5 para los tubos restantes. Una serie de diluciones con cinco concentraciones diferentes (diluciones de 1, 10, 100, 1000 y 10.000) ya está listo.</li>
		<li>Esterilizar las bocas de los tubos de vidrio y los tapones de goma de silicona como se describe en el paso 2.1.2. Los tubos con los tapones de la tapa. Evitar la contaminación por no arrugar los tapones de goma de silicona.</li>
		<li>Colocar cinco tubos en una incubadora con agitación a 37 ° C y se agita a 200 rpm. Incubar el cultivo durante la noche o para h. de 10 a 30</li>
	</ol></li> <li>Selección de la cultura para el stock de glicerol <ol><li>Coloque el medio precalentado temperatura M63, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl y una cubeta desechable en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir 1000 μl M63 a una cubeta desechable con un P-1, 000. Coloque la cubeta desechable en un espectrofotómetro, iniciar el programa en una longitud de onda fija de 600 nm y medir el espacio en blanco.</li>
		<li>Hacia los tubos de vidrio de cinco de la incubadora sacude el Banco limpio.</li>
		<li>M63 descartar de la cubeta desechable y añadir 1.000 cultura μl a la misma cubeta desechable con un P-1, 000. Medir la turbidez óptica de la cultura de célula (OD 600) como se describe en el paso 2.2.2. 
		Nota: Para evitar cualquier contaminación y lograr una medición precisa, exponga los tubos de vidrio y los tapones de la llama como se describe y el vórtice de la cultura antes de muestreo. Para asegurar resultados confiables, se recomiendan mediciones repetidas, sobre todo cuando la densidad celular es baja.</li>
		<li>De los cinco cultivos celulares, elegir una que se encuentra en la fase temprana de crecimiento exponencial (OD 600 = 0.01 - 0.05) para el caldo glicerol. 
		Nota: Si varias culturas tienen densidades dentro de la gama óptima, el uno más cercano a 0,05 es comúnmente seleccionado.</li>
	</ol></li> <li>Hacer las poblaciones de glicerol por repetidas pruebas. 
	Nota: Esto se describe para la preparación de las diez poblaciones. Cantidades más grandes o más pequeños se pueden hacer según los requisitos experimentales.
	<ol><li>Coloque la solución de glicerina 60% esterilizada, diez esterilizar microtubos de 1,5 mL, P-1,000 y P-200, puntas de pipeta de 1.000 y 200 μl y un microtubo en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir 250 μl esterilizada 60% solución de glicerol y 750 μl de la cultura de la celda seleccionada a los microtubos de 1,5 mL y mezclar mediante pipeteo. 
		Nota: El volumen de acciones es variable, pero siempre mantener una relación de 1:3 de 60% de glicerol para cultivo celular; Esto resulta en una concentración final de glicerol al 15%.</li>
		<li>Colocar los nueve microtubos restantes en el stand de microtubos y dispensar 100 μl de la mezcla preparada en el paso 2.3.2 a cada tubo. Ahora hay diez poblaciones de glicerol idénticos para su uso futuro.</li>
		<li>Almacenar las existencias en un congelador a -80 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Adquisición de las curvas de crecimiento <ol><li>configurar el lector de microplacas. 
	Nota: Los términos que se muestra en las comillas muestran el fraseo específico utilizado en el lector de placa utilizado aquí (véase la tabla de materiales).
	<ol><li>Abrir el software. Abierto &#34; protocolos de &#34; en &#34; el administrador de tareas &#34; y elija &#34; crear nuevo &#34;. Elegir &#34; protocolo estándar &#34;.</li>
		<li>Abierta &#34; procedimiento &#34; y ajustar la configuración. Abierto &#34; temperatura &#34; y seleccione &#34; en la incubadora &#34;. Set &#34; temperatura &#34; a 37 ° C y &#34; gradiente &#34; a 0 ° C. Revise &#34; precalentamiento &#34; antes de continuar con el siguiente paso. Abierto &#34; empezar cinética &#34;, establecer &#34; tiempo de ejecución &#34; para 24:00:00 o 48:00:00, y &#34; intervalo de &#34; de 00:30:00 o 1:00. 
		Nota: Tarda aproximadamente 1 minuto para leer un entero 96 placa bien.</li>
		<li>Abierta &#34; Shake &#34; y &#34; modo de agitar &#34; como &#34; lineal &#34;. Compruebe &#34; Constitution Shake &#34; y &#34; frecuencia &#34; en 567 cpm. Abierto &#34; leer &#34;, compruebe &#34; absorbancia &#34;, &#34; punto final/cinética &#34;, y &#34; monocromadores. &#34; Set &#34; longitud de onda &#34; 600.</li>
		<li>Clic &#34; validar &#34; para confirmar que el procedimiento es correcto. Haga clic &#34; guardar &#34; para guardar como un nuevo programa para el uso futuro.</li>
	</ol></li> <li>En tiempo real de grabación de crecimiento <ol><li>dibujar un pictograma de la placa de 96 pozos (8 × 12 tabla) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculados en la placa de 96 pocillos. Imprimir la tabla y utilizarla como referencia para el experimento de. 
		Nota: Los pozos situados en los bordes de la microplaca sólo deben contener medio en blanco debido a la evaporación.</li>
		Microplacas de fondo <li>lugar un piso de 96 pocillos estéril con tapa P-1000, puntas de pipeta de 1000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μL, varios microtubos de 1,5 mL, una pipeta multicanal de 8, un reservorio de reactivo esterilizada, temperatura M63 y el glicerol acciones (preparadas en el paso 2.3) en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir aproximadamente 25 mL M63 para el depósito de reactivo. Uso de este stock de reserva de todos los pasos siguientes.</li>
		<li>Agregar 900 μl M63 en los microtubos en preparación para hacer diluciones seriadas.</li>
		<li>Descongelar el stock de glicerol a temperatura ambiente. Agregar 900 μl M63 stock de glicerol descongeladas y vortex. Esto resulta en una dilución de 10 veces del original stock de glicerol de.</li>
		<li>Transferir 100 μl de la dilución de 10 veces a otro microtubo que contiene 900 μl de M63 y vortex. Esto resulta en una 100-fold dilución.</li>
		<li>Repetir paso 3.2.6 hasta conseguir el número de diluciones deseado es.</li>
		<li>Llenar los pozos en el borde de la microplaca con 200 μL M63 utilizando una pipeta de 8 canales (P-200). 
		Nota: Estos pozos se pueden utilizar como el espacio en blanco.</li>
		<li>Carga 200 μL de cada muestra en pasos 3.2.4 - 3.2.7 en los pocillos de la microplaca según la tabla de referencia (paso 3.2.1) diluida. Vórtice el antes las muestras diluidas de carga y carga la misma muestra en pozos múltiples en variados lugares en la placa de.</li>
		<li>Coloque la microplaca de 96 pocillos en el lector de placas de.</li>
		<li>Abierta &#34; leer ahora &#34; en &#34; el administrador de tareas &#34; y elegir el programa (sección 3.1). Haga clic en &#34; OK &#34; para comenzar a medir. Guardar la grabación como un nuevo archivo experimental para análisis de datos (sección 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Análisis de datos <ol><li>exportar los resultados de los datos en tiempo real tasa de crecimiento (sección 3.2) a una memoria USB stick como un archivo de texto. 
	Nota: Un resultados con formato de 96 pocillos (curvas) se mostrarán en el lector de la placa en tiempo real. Los registros por hora (valores de OD) pueden ser exportados como una tabla; las filas y las columnas representan los números bien (por ejemplo, A1, B1) y el tiempo de medición (por ejemplo, 00:00:59), respectivamente.</li>
	<li>Abrir el archivo de texto con un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Copiar las lecturas cada hora de 600 OD de la microplaca de 96 pozos en una nueva hoja de cálculo para su posterior análisis.</li>
	<li>Restar el fondo lee en el tiempo cero de las lecturas cada hora de cada muestra bien. 
	Nota: Para mayor comodidad, el valor medio del espacio en blanco pozos que contienen M63 (paso 3.2.8) puede ser utilizado como el valor de fondo.</li>
	<li>Calcular la media de cinco consecutivos OD 600 lecturas para estimar la densidad de población máxima. 
	Nota: El mayor valor promedio de OD 600 cinco Lee consecutivo se define como el máximo de OD 600 de la curva de crecimiento correspondiente.</li>
	<li>Calcular la tasa de crecimiento, μ (h -1), aplicando la siguiente ecuación para todos los pares de valores consecutivos de OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Nota: en esta ecuación, C y C i + 1 representan los valores de OD 600 de cualquier dos puntos de tiempo consecutivos (t y t i + 1, ««««respectivamente). LN indica logaritmo natural.</li>
	<li>Calcular los cambios en la tasa de crecimiento en el tiempo basados en la hora OD 600 Lee según el paso 4.6. Calcular la media y la desviación estándar de cinco crecimientos consecutivos para estimar la tasa de crecimiento máxima. 
	Nota: El promedio mayor con la menor desviación estándar se define como la tasa de crecimiento máxima de la curva de crecimiento correspondiente.</li>
</ol> 5. Confirmando la tendencia Global de las lecturas de 96 pocillos (opcional) Nota: tanto la placa del lector y la placa de 96 pocillos consumible pueden causar mediciones sesgadas. Para lograr resultados cuantitativos muy precisos y reproducibles, confirmando la tendencia global de la placa de 96 pocillos está altamente-recomendado.
<ol><li>Preparar la placa de 96 pocillos y el lector de la placa para la prueba de sesgo, como se describe en la sección 3.2.2.</li>
	<li>Añadir 20 mL M63 a un tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado. Añadir el caldo glicerol al mismo tubo de centrífuga y vortex. Transferir la solución suspendida a un reservorio de reactivo esterilizada.</li>
	<li>Use una pipeta de 8 canales para transferir 200 μL de la solución de suspensión a la placa de 96 pozos.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en el lector de placas y comenzar la medición.</li>
	<li>Registro hora OD 600 Lee y analiza como se describe en la sección 4. Comparar la densidad de población y tasa de crecimiento máxima calculada de cada pozo para determinar sesgo localización de 96 pocillos Lee.</li>
</ol>

<ol>
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Agradecemos a Kohei Tsuchiya para dar el ejemplo de ensayo de UFC. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una subvenciones para la investigación científica (C) no. 26506003 (a BWY) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología, Japón.

Pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de una acción común de crecimiento exponencial las células y la replicación de las mismas muestras en pozos múltiples en diversas posiciones en la microplaca. Previamente, microbiólogos comenzaron la cultura de una cultura de la noche. Mientras que este método puede reducir el tiempo de retraso del crecimiento bacteriano, es difícil de conseguir las curvas de crecimiento reproductivo. Como se muestra en la figura 2, las mediciones independientes utilizando los stocks de glicerol común dio lugar a las curvas de crecimiento casi idénticos, que ofrecen resultados reproducibles y precisos. Como se muestra en la figura 3, pozos en diferentes lugares de dan lecturas ligeramente distintas, que se considera el fondo global de las mediciones. Para la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano, se debe considerar esta situación. Inoculación de muestras en pocillos múltiples en localizaciones variadas placa para replicación experimental es muy recomendable para tener en cuenta el sesgo global.
Además de manejar errores, se deben considerar la modificación y resolución de problemas derivados de los dispositivos experimentales y suministros. Varios lectores de microplacas avanzada están comercialmente disponibles. Muestran una amplia variación en características, tales como el método de ajuste de la longitud de onda de luz, el modo de calefacción o de refrigeración y la forma y frecuencia de los temblores. Basándonos en nuestra experiencia, evaporación debe abordarse en estudios de alto rendimiento debido a cambios en el volumen del líquido influyen grandemente OD600 lecturas. Evaporación es causada por el método de calefacción utilizado por los lectores de microplacas y la arquitectura de las placas. Los dos modos de calefacción comúnmente implementado en los lectores de microplacas comercial son la calefacción por aire caliente y calefacción con una placa caliente. El lector de microplacas utilizado en este protocolo utiliza la placa como un método de calentamiento para disminuir la evaporación porque el medio en la microplaca se seca rápidamente en el aire caliente que sopla. Las placas también deben ser cuidadosamente seleccionados. Microplacas de 96 diferentes pocillos (con tapas) causan diferentes niveles de evaporación. El método descrito utiliza el formato de la placa con una tapa cubierta profunda, que reduce la evaporación.
Por otra parte, si el estudio exige el análisis de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, entonces la forma y frecuencia de temblores en el lector de microplacas deben tenerse en cuenta. Agitación durante la cultura asegura que el crecimiento las células se suspenden uniformemente en los medios de comunicación. Agitación inadecuada o baja frecuencia pueden causar las células alrededor del borde del pozo o en el centro con una densidad alta, dando por resultado falsas lecturas que son inferior o superior a la real lee la pila. El método descrito utiliza lineal, bidireccional temblando. Mientras que el modo de agitación en forma de 8 es probablemente suficiente, no se recomienda el modo circular de agitación.
La principal limitación de este método es la evaporación del medio de cultivo celular. Puesto que el volumen máximo de la cultura es pequeño, es decir, 200 μL, incubación a 37 ° C produce evaporación importante. Así, este método no es adecuado para el cultivo de más de 48 h. Además, cultivos de células de baja densidad deben evitarse porque detección óptica (OD600) se limita a estas densidades. Cuando se consideran juntos, células/cepas de crecimiento muy lentas o muy baja concentración inicial las culturas no son preferidas, ya que requieren más tiempo y son por debajo del límite de detección de OD600.
Este método produce mediciones precisas, alto rendimiento, que son muy ventajosas para encuestas sistemáticas. Como un resultado representativo, este método permite para evaluar una variedad de cepas de e. coli con varias secuencias genómicas o medio fácil y reproducible5. En comparación con los métodos tradicionales de cultivo en tubos y medir manualmente muestras en diferentes puntos temporales, el método descrito es menos trabajo y tiempo intensivo. Futuras aplicaciones y desarrollo del método se supone que implican la automatización de la manipulación experimental y análisis computacional. Aplicación automática de medición y robótica conducirá a un método altamente eficiente y confiable de evaluar el crecimiento de la célula y realizar pruebas de supervivencia usando células bacterianas y de mamíferas.

Estudios microbiológicos a menudo comienzan con el cultivo de las células bacterianas y la evaluación de las curvas de crecimiento bacteriano, que representan un fenómeno fundamental de la fisiología bacteriana1,2,3. Principios básicos de la cultura están ampliamente disponibles en la literatura de los estudios publicados y los libros de texto porque la cultura bacteriana es una metodología fundamental. A nivel Banco, considerable atención se ha centrado tradicionalmente en optimización de medios de cultivo y condiciones de cultivo, pero controla la tasa de crecimiento, que probablemente daría aún mayor comprensión de la fisiología microbiana, no ha sido ampliamente estudiados4. Para el crecimiento exponencial de bacterias, un parámetro clave del estado celular es la tasa de crecimiento, que se ha divulgado para ser coordinado con el genoma, transcriptoma y proteoma5,6,7,8 . Así, la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es crucial para la comprensión de fisiología microbiana.
Para evaluar el crecimiento bacteriano, los métodos experimentales utilizados para estimar la biomasa están bien establecidos9,10 y se basan en la detección de parámetros bioquímicos, físicos o biológicos, como la turbidez óptica. Además, los métodos analíticos utilizados para capturar las propiedades dinámicas de los cambios de crecimiento se basan comúnmente en modelos no lineales establecidos11,12,13, por ejemplo, las ecuaciones logísticas. Dinámica de crecimiento se adquiere generalmente por tiempo muestreo del crecimiento celular en cultivo por medición de turbidez óptica o realizar pruebas de unidad (UFC) formadoras de colonias. La limitación de estos métodos de cultivo y detección es que los puntos no son un fiel reflejo de la dinámica de la población porque los intervalos de medición son a menudo en horas y la condición de la cultura (p. ej., cambios de temperatura y aireación) se altera en el momento de muestreo. Técnicas de cultivo y análisis deben ser actualizadas con los acontecimientos recientes en la tecnología y la comprensión. Los avances recientes en los lectores de microplacas permiten la observación en tiempo real del crecimiento bacteriano y disminuyen significativamente los costos laborales. Usando estos dispositivos avanzados, los estudios más recientes sobre crecimiento bacteriano han publicado métodos analíticos para mediciones de alto rendimiento14,15.
El propósito de este protocolo es evaluar la dinámica de crecimiento precisa de una manera de alto rendimiento, que será de gran valor para estudios cuantitativos que en última instancia, responder las preguntas de cómo se determina la tasa de crecimiento y los factores que afectan la tasa de crecimiento. El protocolo aborda todos los factores que deben tenerse en cuenta para la cuantificación precisa y repetible de crecimiento bacteriano. El método experimental y el análisis se describen en detalle en el texto principal. Este método permite el análisis preciso y reproducible de crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Microbiólogos pueden utilizar este protocolo para obtener resultados cuantitativos adicionales de su evidencia experimental. Este protocolo también puede utilizarse para estudios en biología de sistemas que tratan de sacar conclusiones conceptuales o para lograr un resumen teórico de crecimiento.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 1,000 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 multichannel-pipette</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRRER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Glass cylinder (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Precision pH mater</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Microtube stand</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &amp;micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Disposal cell (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Beaker (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO clean bench</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber stoppers</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Crecimiento bacteriano es un concepto central en el desarrollo de la moderna fisiología microbiana, así como en la investigación de la dinámica celular a nivel de sistemas. Estudios recientes han reportado correlaciones entre el crecimiento bacteriano y eventos de todo el genoma, como reorganización de reducción y transcriptoma de genoma. Analizar correctamente el crecimiento bacteriano es fundamental para entender la coordinación dependiente del crecimiento de las funciones de genes y componentes celulares. Por consiguiente, se requiere la evaluación cuantitativa precisa del crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Desarrollos tecnológicos emergentes ofrecen nuevas herramientas experimentales que permiten la actualización de los métodos utilizados para el estudio de crecimiento bacteriano. El protocolo introducido el emplea a un lector de microplacas con un procedimiento experimental altamente optimizado para la evaluación precisa y reproducible del crecimiento bacteriano. Este protocolo fue utilizado para evaluar el crecimiento de varias cepas de Escherichia coli ha descrito anteriormente. Los pasos principales del protocolo son las siguientes: la elaboración de un gran número de poblaciones de células en pequeños viales de repetidas pruebas con la reproducibilidad, la utilización de placas de 96 pocillos para la evaluación del crecimiento de alto rendimiento y el cálculo manual de dos grandes parámetros (es decir, densidad de población y tasa de crecimiento máxima) que representa la dinámica de crecimiento. En comparación con el tradicional análisis de unidad (UFC) formadoras de colonias, que cuenta con las células que se cultivan en tubos de vidrio con el tiempo en placas de agar, el presente método es más eficiente y proporciona más registros temporales de los cambios de crecimiento, pero tiene una más estricta límite de detección a densidades de población bajas. En Resumen, el método descrito es ventajoso para el análisis de alto rendimiento precisa y reproducible del crecimiento bacteriano, que puede utilizarse para sacar conclusiones conceptuales o hacer observaciones teóricas.

El método descrito proporciona un medio para capturar la dinámico crecimiento bacteriano de manera continua, de alto rendimiento utilizando un lector de formato de 96 pozos que tiene varias mediciones de densidad óptica a diferentes intervalos de tiempo (desde minutos a horas o días). Las curvas de crecimiento de una variedad de cepas de e. coli expresan diversos genomas pueden adquirirse precisamente en un solo experimento (figura 1A). En comparación con el método descrito, el método tradicional (el ensayo de UFC) generalmente requiere más largos intervalos de tiempo de muestreo (figura 1B) y es mano de obra si se requiere el cultivo múltiple. Además, cada tiempo de muestreo de cultivo para el ensayo de UFC requiere el uso de un pequeño volumen de cultivo celular que no puede utilizarse para mediciones repetidas. Además, un número limitado de puntos de tiempo para la detección puede pasar por alto los puntos de muestreo que son necesarios para el correcto cálculo de la tasa de crecimiento y el máximo de OD600. Sin embargo, el ensayo de UFC tiene un límite de detección inferior, 103 - 104 células/mL, lo que por lo menos dos órdenes de magnitud más sensible que el análisis de turbidez óptica (OD600= 0.001, que tiene un límite de detección de aproximadamente 105 -106 células/mL). El método descrito proporciona una práctica y eficiente herramienta experimental para estudios a nivel de sistemas en la dinámica de crecimiento.
Una ventaja clave de este protocolo es que se requiere de mediciones repetidas de una acción común de glicerol. Tener múltiples cultivos celulares con diferentes tasas de dilución en fase temprana de crecimiento exponencial es muy útil porque permite a los investigadores a determinar el tiempo de la cultura en cualquier escala de tiempo y evita tener saturada de culturas debido a eventos impredecibles. Repetidas mediciones de las acciones comunes, que fueron preparadas desde una de las cinco culturas iniciadas utilizando las tasas de dilución diferentes como se describe en el protocolo sección 2.2 (figura 2A), presentada resultados muy similares de crecimiento y cultivo Análisis de la dinámica. Múltiples curvas de crecimiento de repetidos e independientes medidas (N = 6) bien superpuestas (figura 2Bpanel superior), con poca varianza (figura 2Bpanel inferior), especialmente durante la fase exponencial ( Figura 2B, área sombreada). Estos resultados sugieren que el método descrito proporciona resultados altamente reproducibles.
Se recomienda estimar el sesgo global de la muestra de 96 pocillos. En el presente método, el sesgo global se calcula controlando el crecimiento de la de tipo e. coli W3110 la tensión según se describe en la sección 5 del protocolo. Por ejemplo, las tasas de crecimiento calculan de las curvas de crecimiento mostraron una variación significativa entre los 96 pocillos (Figura 3A), que representan la fluctuación mundial derivada de la manipulación de datos y los errores del dispositivo. Estos errores se pueden enmascarar por la carga de la misma muestra en pozos múltiples en diversas localizaciones en la placa. Por el contrario, el máximo de OD600 mostró un sesgo claramente dependiente de la ubicación de los resultados, como se observaron cambios graduales a lo largo de la dirección vertical, es decir, el máximo de OD600 gradualmente pasó de los pocillos de la columna 2 a los de columna 11 de la placa de 96 pocillos (figura 3B). Para evitar resultados sesgados, la misma muestra se recomienda en los pozos localizados en ambos lados de la placa de 96 pocillos para medidas repetidas. El sesgo de localización en valores máximos de600 de OD se supone que el resultado de la variación en las tasas de evaporación, que son determinadas por la calefacción y la eficiencia de sellado. En comparación con los pozos en medio de la microplaca de 96 pocillos, los pozos situados en los bordes tendieron a mostrar valores relativamente más altos, que reflejan las tasas de evaporación variadas resultantes del efecto del lacre de la microplaca. Además, puesto que otras microplacas de 96 pozos sometidos a la misma prueba de sesgo demostraron cambios direccionales similares en donde el pozo se encuentra en la placa base, la medida de la diagonal puede depender del lector de placas. Por lo tanto, es importante evaluar el sesgo global de 96 pocillos lee en estudios que determinan la densidad de población máxima. Lectores de placa disponibles comercialmente tienen su sesgo global específica causada por el calentamiento y sacudiendo las eficiencias y las microplacas de 96 pocillos se diferencian en gran medida por eficiencia de sellado.
Este método está diseñado para el análisis sistemático del crecimiento bacteriano, y puede ser utilizado para analizar dos parámetros principales, es decir, densidad célula y tasa de crecimiento, que comúnmente se aplican en una amplia variedad de campos, tales como biología de sistemas, evolución, y Ecología16,17. Se introduce el cálculo manual utilizando hoja de cálculo para mostrar la transformación de la materia prima Lee para producir los parámetros evaluados de la densidad de célula y tasa de crecimiento. Primero se calculan las tasas de crecimiento por hora el raw Lee de la curva de crecimiento (Figura 4A) según protocolo sección 4.6 como un conjunto de datos de cambios secuenciales en las tasas de crecimiento (Figura 4B). Las medias y desviaciones estándar de cada cinco crecimientos consecutivos son adquiridas secuencialmente (figura 4-D), y la mayor tasa de crecimiento con la menor desviación estándar se define como la tasa de crecimiento máxima del crecimiento curva (figura 4-D, destacó). La densidad celular máxima (OD600) se analiza de manera similar (figura 4E-F). La densidad de célula y tasa de crecimiento calculada posteriormente son sometidos a más análisis. Tenga en cuenta que los cálculos descritos pueden automáticamente realizar plataformas computacionales (lenguajes de programación), por ejemplo, R y Python.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig1.jpg"> 
Figura 1 las curvas de crecimiento adquiridas con diversos métodos. (A) múltiples adquisiciones de las curvas de crecimiento. Las curvas de crecimiento de cuatro diferentes cepas de e. coli expresan diversos genomas fueron obtenidas de un modo de alto rendimiento. Las células de e. coli fueron cultivadas en M63 medio mínimo, y los cambios en OD600 lecturas fueron registrados por un lector de microplacas a intervalos de 1 h. Las cepas de izquierda a derecha el tipo salvaje de e. coli W3110 (número 0) y sus genomas reducidos números 1, 10 y 18 (describen previamente5), respectivamente. (B) curva de crecimiento obtenida utilizando el ensayo de UFC. El tipo células de e. coli (número 0) fueron cultivadas y se tomaron muestras en los puntos de tiempo indicado durante varias horas. Los cambios de crecimiento se estimaron usando el ensayo de UFC. Círculos abiertos indican la grabación o puntos de muestreo. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56197/56197fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig2.jpg"> 
Figura 2. Reproducible repetidas medidas de. Culturas durante la noche (A) de la tasa de dilución variadoss. las células de e. coli se inocularon en tubos con múltiples tasas de dilución, que varió de 1-10,000-fold, como se indica. Las células fueron cultivadas a 37 º C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 12 horas. Los valores finales de la600 del OD de las culturas de cinco célula (de izquierda a derecha) fueron 1.51, 0.74, 0.05, 0.008 y 0.001, respectivamente. La cultura con OD600 de 0.05 se utilizó para la acción común de glicerol. (B) medidas altamente reproducibles. Seis curvas de crecimiento independientes (líneas arriba, gris) de la misma cepa de e. coli fueron adquiridas y calculadas a partir de seis posiciones en la microplaca y dos viales de la acción común de glicerol. La línea negra representa el promedio de las curvas de crecimiento de 6. Los coeficientes de variación (CV) de las seis mediciones repetidas fueron calculado (abajo), y los constantes puntos bajos son sombra de color rosa. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56197/56197fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig3.jpg"> 
Sesgo Global Figura 3 del formato de 96 pozos. Mapa de calor (A) de las tasas de crecimiento. La población de células de e. coli fue suspendida en M63 medio mínimo y cargada igualmente de los 96 pocillos de la microplaca (representado como una tabla de 12 × 8). Los cambios en OD600 fueron obtenidos usando el lector de microplacas, tal como se describe en la sección 5 del protocolo. La gradación de blanco a rojo indica las tasas de crecimiento de 0,7 a 0,9 h-1. (B) mapa de calor de la OD máximo600. La gradación de blanco a rojo indica los valores de600 OD máximos de 0.9 a 1.2. Los cálculos de la tasa de crecimiento y máximo OD600 son como se describe en la figura 4. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56197/56197fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig4.jpg"> 
Figura 4 análisis de las curvas de crecimiento. (A) datos de las curvas de crecimiento. Las lecturas de600 por hora de OD se trazan contra el tiempo de la cultura. Círculos abiertos indican los tiempos de muestreo. Temporal (B) cambios en las tasas de crecimiento. Las tasas de crecimiento por hora entre dos consecutivos OD600 lecturas se calculan según la ecuación descrita en 4.6. (C) significa que las tasas de crecimiento. La media de cinco crecimientos consecutivos se calculan a las tasas de crecimiento suave. (D) desviaciones estándar de las tasas de crecimiento promedio. Se calcula la desviación estándar de las tasas de crecimiento consecutivas cinco mismo. La tasa de crecimiento máxima con la menor desviación de estándar está resaltada en rojo. (E) significa OD600. Se calcula la media de cinco consecutivos OD600 valores para determinar el OD lisa600. (F) desviaciones estándar de la media OD600 . Se calcula la desviación estándar de los mismos cinco consecutivos OD600 valores. El máximo de OD600 con la desviación estándar más pequeña está resaltado en rojo. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56197/56197fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano

Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K vistas.  University of Tsukuba. Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Investigación

Genética

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Enhanced Reproducibility and Precision of High-Throughput Quantification of Bacterial Growth Data Using a Microplate Reader

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth rate. The growth curves and maximum growth rates of two bacterial species were determined. Issues including (i) lid condensation, (ii) pathlength correction, (iii) inoculation size, (iv) sampling time interval, and (v) spatial bias were investigated. The repeatability of the protocol was assessed with three independent technical replications, with a standard deviation of 0.03 between the runs. The maximum growth rates of Bacillus mycoides and Paenibacillus tundrae were determined to be&#160;(mean&#160;&#177; SD) 0.99 h&#8722;1 &#177;&#160; 0.03 h&#8722;1 and 0.85 h&#8722;1 &#177; 0.025 h&#8722;1, respectively. These bacteria are more challenging to monitor optically due to their affinity to clump together. This study demonstrates the critical importance of inoculation size, path length correction, lid warming, sampling time intervals, and well-plate spatial bias to obtain reliable, accurate, and reproducible data on microplate readers. The developed protocol and its verification steps can be expanded to other methods using microplate readers and high-throughput protocols, reducing the researchers&#39; innate errors and material costs.

Here, a high-throughput protocol is presented to measure growth data, including growth curves, growth rate, and maximum growth rate. The protocol was verified and validated using two biofilm-producing bacteria. The results and approach applied in this study can be expanded to other high-throughput protocols using microplate readers.

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth ...

Medio ambiente

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Inmunología e Infección

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Biología

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Uso de Microtiter Dish Radiolabeling para mediciones múltiples in Vivo de Escherichia coli (p)ppGpp seguido de cromatografía de capa fina

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...