Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Los autores desean agradecer a V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger y K. Svoboda del Proyecto GENIE (Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector) en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes por su generosa donación de AAV1-GCaMP6f A la Universidad de Pennsylvania Vector Core. También les gustaría dar las gracias al A. Olson y Neuroscience Microscopy Core en la Universidad de Stanford apoyado por NIH NS069375 subvención para sus servicios de microscopía confocal.

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Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes intereses en competencia: SG, SO y VC son empleados pagados en Inscopix.

La comprensión de la actividad del circuito neural durante el comportamiento despierto es un nivel vital de investigación neurocientífica necesaria para diseccionar eficazmente la función cerebral en la salud y la enfermedad. La corteza es una región particularmente importante para estudiar en el contexto del comportamiento despierto, ya que desempeña un papel importante en muchas funciones sensoriales, cognitivas y ejecutivas vitales 28 , 29 . Se cree que la columna cortical es la unidad funcional básica en la corteza y se sabe que la actividad a nivel de población de las células corticales difiere en función de su ubicación física dentro de la columna. Por ejemplo, las neuronas excitatorias en capas 2/3 en la corteza somatosensorial se proyectan principalmente a otras regiones neocorticales y modulan otras redes corticales 30 , mientras que las células en capas más profundas se proyectan principalmente a regiones subcorticales como el tálamo 31 . Registro de la actividad de cienS de las células corticales preespecificadas simultáneamente y de forma fiable a lo largo del tiempo a través de diferentes láminas en sujetos que se comportan libremente, mejorarían considerablemente nuestra comprensión del flujo de información cortical, permitiendo una más fina disección funcional de las columnas corticales informadas por información conductual en tiempo real, escamas. La recopilación de este nivel de datos de circuitos neuronales se hace posible con el uso de una plataforma de microscopía miniaturizada eficiente y aerodinámica para llevar a cabo la formación de imágenes de Ca 2+ a gran escala en sujetos que se comportan libremente (o sujetos fijados a la cabeza según se desee). Utilizado con los indicadores de calcio genéticamente codificados para permitir la focalización específica de tipo celular y la obtención de imágenes de un campo de visión de múltiples capas proporcionado por una sonda de prisma crónicamente implantada, este protocolo exploró un caso entre muchas aplicaciones posibles: observar diferencias laminares en procesamiento cortico somatosensorial cuando ratones Físicamente comprometido con un objeto novedoso ( Figura 5 ).Esta es la primera ilustración procedural de este tipo de método específico de tipo celular in vivo para estudiar múltiples capas corticales en animales despiertos y que se comportan libremente y amplía el espectro de métodos experimentales disponibles para comprender las estructuras laminares en el cerebro activo. El campo de visión periscópico habilitado por la sonda de prisma en esta técnica puede aplicarse de manera factible a otras estructuras cerebrales cuando se desea la preservación del tejido directamente dorsal a una región de interés; Por ejemplo, la obtención de imágenes CA3 podría lograrse sin interrupción de la función del hipocampo. El enfoque basado en la sonda de prisma para la obtención de imágenes de la actividad de Ca 2+ requiere la inserción física y la implantación permanente de un microprisma en la corteza, lo que equivale a la creación de una lesión cortical donde se inserta la sonda de lente. Esto puede resultar en interrupciones de los circuitos neuronales locales, incluyendo el corte de dendritas apicales y procesos. TSu procedimiento también causará una activación inicial de las células gliales en la región, aunque se espera que esté localizada en el tejido a unos 150 μm de la cara del prisma, y ​​que se disipe después de que el cerebro haya cicatrizado 22 . Es muy importante considerar si esta técnica afectará la anatomía normal del circuito y / o el comportamiento de los animales al planear experimentos. Siempre deben llevarse a cabo grupos de control conductual para asegurar que no haya alteraciones significativas en los comportamientos basales que podrían producir resultados confundidores experimentales. Utilizando esta técnica miniaturizada de imágenes de Ca 2+ móvil con manipulación neurofarmacológica, diversos paradigmas cognitivos, sociales, motores o intrínsecos de comportamiento, y combinándolo con otras métricas fisiológicas pueden profundizar y enriquecer los estudios enfocados en la comprensión de los roles funcionales de los circuitos neuronales en el comportamiento y la señal Procesamiento 32 . Supresión o activaciónLa modificación de ciertas vías moduladas por fármacos puede influir en comportamientos asociados, que pueden ser fácilmente estudiados utilizando esta tecnología 33 . Ramificación en diferentes tipos de células mediante la modificación de la orientación del indicador de calcio es otra aplicación potente y útil, y permite muchas combinaciones creativas de herramientas experimentales para abordar diversas preguntas del circuito neuronal.

La corteza es un actor esencial en muchas funciones mentales y de comportamiento complejas, desde la atención, la percepción sensorial y el control cognitivo de arriba hacia abajo 1 , 2 , 3 a las vías de motivación, recompensa y adicción 4 , 5 . La comprensión de los procesos computacionales que subyacen en su función es un objetivo importante para impulsar una mejor comprensión clínica de muchos trastornos mentales y del comportamiento. Muchas teorías actuales de la enfermedad psiquiátrica se centran en torno a la idea de que la disfunción del circuito neural cortical o la discordiación puede ser la causa de anormalidades cognitivas y conductuales que son las características de condiciones como la esquizofrenia 6 , el autismo 7 o el trastorno obsesivo-compulsivo 8 . Por lo tanto, la obtención de datos de la actividad neural de la población de coRtical circuitos dentro del contexto adecuado de la información de comportamiento simultánea es de gran importancia, y idealmente puede ser dirigido a tipos de células específicas para una disección de circuito neural más fino. Los microscopios miniaturizados junto con las microlentes de índice de refracción de gradiente implantables (GRIN) permiten el acceso óptico a conjuntos neuronales bajo condiciones de movimiento libre desde una diversidad de posibles regiones cerebrales 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluyendo la corteza 14 , 15 , 16 . El uso de un sistema de microscopía móvil, junto con los indicadores de calcio genéticamente codificados permite imágenes consistentes de la misma población celular que abarca cientos de neuronas durante días o semanas en muchas regiones del cerebro [ 9] , y puede serGenéticamente dirigidos a tipos celulares específicos utilizando vectores virales o técnicas transgénicas. Como se sabe que la corteza soporta diferentes funciones y se conecta a diferentes regiones cerebrales dependiendo de la ubicación de las células dentro de la lámina cortical 17 , 18 , 19 , estamos interesados ​​en obtener simultánea actividad neuronal multicapa en sujetos que se comportan despiertos. Aquí se demuestra cómo la imagen de cientos de neuronas marcadas fluorescentemente en los ratones que se comportan libremente durante días, utilizando el microscopio de fluorescencia miniaturizado 20 emparejado con una sonda de prisma implantado, que ofrece una visión multicapa de la corteza ( Figura 1 ). La sonda de prisma usada aquí está compuesta por dos lentes GRIN separadas: un prisma y una lente relé cilíndrica ( Figura 1 ). La luz del microscopio excita el marcado fluorescenteCélulas situadas a lo largo de la cara de formación de imágenes de la sonda de prisma, después de haber sido reflejadas por la hipotenusa de la porción de prisma de la sonda. La luz emitida de las células también refleja la hipotenusa del prisma, se recoge a través del objetivo del microscopio y llega al sensor en el microscopio. La sonda de prisma utilizada en este procedimiento está adaptada para facilitar su uso con equipos estereotáxicos estándar. El microscopio de fluorescencia miniaturizado 20 detecta transitorios de Ca 2+ potencialmente evocados potencialmente en poblaciones neuronales con una sola resolución de células, después de que dichas células han sido específicamente marcadas con indicadores fluorescentes codificados genéticamente con Ca2 + . En este protocolo, se inyecta Ca 2 + indicador codificado en un vector viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), el implante de una sonda de prisma, instalar el microscopio, a continuación, obtener varios días de somatosensorial (S1 miembro posterior) datos de actividad neuronal De una exposición de animalesD a nuevas superficies de objetos durante la exploración libre ( Figura 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

El circuito in vivo y la imagen funcional de nivel celular es una herramienta crítica para entender el cerebro en acción. Imágenes de alta resolución de las neuronas corticales de ratón con microscopía de dos fotones ha proporcionado una visión única en la estructura cortical, la función y la plasticidad. Sin embargo, estos estudios se limitan a los animales fijos de la cabeza, reduciendo en gran medida la complejidad del comportamiento disponible para el estudio. En este artículo, se describe un procedimiento para realizar la microscopía de fluorescencia crónica con la resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se comportan libremente. Utilizamos un microscopio de fluorescencia miniaturizado integrado emparejado con una sonda de prisma implantada para visualizar y registrar simultáneamente la dinámica del calcio de cientos de neuronas a través de múltiples capas de la corteza somatosensorial mientras el ratón participaba en una nueva tarea de exploración de objetos durante varios días. Esta técnica puede adaptarse a otras regiones cerebrales de diferentes especies animales para otras pAradigmas

El protocolo descrito aquí describe una manera eficaz y eficiente para realizar longitudinal de múltiples capas Ca 2 + imágenes de cientos de neuronas corticales en libremente comportarse ratones utilizando prisma sondas ( Figura 1 ]. Los enfoques previos hacia la formación de imágenes corticales multicapa se han limitado principalmente a los animales fijos 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Con el fin de adquirir este nivel de datos en un contexto de libre comportamiento, una plataforma de microscopio miniaturizado se utilizó para la flexibilidad de comportamiento, Se usó un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP6f) para dirigir una población celular específica (células CAMKII + en la corteza); Y se eligió una sonda de prisma para proporcionar un campo crónico de visión de múltiples capas. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Hemos demostrado el flujo de trabajo para la preparación del animal para la obtención de imágenes. Se inyectó un vector viral que codifica un indicador de calcio apropiado en la corteza ( Figura 2 , Paso 1), antes de implantar crónicamente una sonda de prisma para permitir el acceso óptico a las células marcadas ( Figura 2 , Etapa 2). Una placa base que sirve como muelle temporal seguro para la colocación del microscopio durante las sesiones de formación de imágenes se instaló entonces sobre la cabeza del animal ( Figura 2 , Paso 3), permitiendo la visualización de la actividad cortical a través de múltiples capas celulares en un comportamiento despierto experimental ( Figura 2 , Paso 4). Para asegurar que la población celular deseada estaba siendo dirigida, en la Figura 3 se muestra una sección cerebral coronal post-mortem de un ratón representativo, con el tracto de sonda prismática y el campo de visión marcados con respecto al laboratorio GCaMP6fEled neuronas en las capas 2/3 y 5 de la corteza somatosensorial. Durante el estado de vigilia, la actividad de las neuronas corticales somatosensoriales se registró cuando el ratón fue expuesto a tres entornos diferentes: campo abierto (día 1), familiarización con el objeto (día 2-4) y objeto novel (día 5) ( Figura 4 ). El día 1 el ratón fue colocado en un campo de comportamiento carente de cualquier objeto. El día 2-4 el ratón fue colocado en la arena con los mismos dos objetos texturalmente diferentes (una almohadilla de gel y un bloque de madera). El día 5, uno de los objetos fue reemplazado por un objeto nuevo. El animal se formó imágenes a lo largo de 5 días durante 20 minutos cada día. Después de la extracción celular utilizando el software de análisis de datos de imagen Ca2 + , se superpusieron filtros espaciales correspondientes a las ubicaciones de células en la proyección de intensidad fluorescente media de los datos de registro de microscopio( Figura 5) . Una línea discontinua blanca separa las capas 2/3 y 5 células. Correspondientes Ca 2 + trazas a partir de 5 células de cada una de las capas muestran el patrón de disparo de las células en dos contextos de comportamiento diferentes - objeto familiarización y novela objeto exposición. Las células de la capa 2/3 eran más activas en comparación con las células de la capa 5 el día en que el ratón fue expuesto a un objeto nuevo. Esto también es evidente a partir de los diagramas de trama que muestran la actividad de activación umbral de todas las células de imagen en los días 1, 4 y 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2 + imágenes a través de múltiples capas corticales en movimientos libres de ratones. ( A ) Especificaciones de la sonda de prisma y representación del plano de imagen. El recubrimiento reflectante en el interior de la hipotenusa permite la formación de imágenes 90 ° desde el plano de inserción de la sonda de prisma. La lente cuFf se integra con el soporte de la lente, lo que agiliza el procedimiento de implantación y permite la visualización potencial de la fluorescencia del tejido ambiental durante la implantación ( B ) (i). Ilustración de la colocación de la craneotomía con sonda de prisma y la incisión del cuchillo en relación con el sitio de inyección del virus, y (ii) la ilustración de la localización del lado plano de la sonda del prisma con respecto a la incisión del cuchillo y el sitio de inyección del virus. ( C ) Ilustración de la configuración de formación de imágenes de Ca 2+ in vivo que muestra el recorrido de la luz para un área pequeña dentro del campo de visión completo a través de la sonda de prisma implantada en la corteza del ratón. ( D ) Ejemplo de campo de visión durante la instalación de la sonda de prisma. Microscopio en miniatura se une al soporte de la lente, que contiene la sonda de prisma que permite comprobar la expresión del virus durante la instalación de la sonda de prisma. ( E ) Integración de microscopio con sonda prismática para la obtención de imágenes corticales multicapa de células S1 marcadas con GCaMP6f. F Ejemplo de campo de visiónDurante la instalación de la placa base. El patrón transparente de vasos sanguíneos es visible en el momento de la instalación de la placa base con algunas células en imagen cruda. Más células son claramente visibles cuando se activa DF / F en la ventana del software de adquisición. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema que muestra la línea de tiempo de los eventos de flujo de trabajo para la implantación de la sonda de prisma y la instalación de microscopio. El número de semanas se representa en el eje X y los pasos del flujo de trabajo de los procedimientos a lo largo del eje Y. ( A ) Gráfico que ilustra la inyección viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) a lo largo del mismo eje dorso-ventral, para etiquetar múltiples capas de la corteza somatosensorial del ratón. ( B ) 2 semanas después de las inyecciones de virus, un problema de prismaE se implanta en un eje que es paralelo a los sitios de inyección de virus. ( C ) Aproximadamente una semana después de la implantación de la sonda de prisma, se comprueba la expresión del animal con el microscopio y se monta una placa de base en la cabeza si una población de células es visible. ( D ) El animal está entonces listo para la imagen crónica durante las tareas de comportamiento relevantes (Clip art de ratón modificado después de permiso de UW-Madison Bioquímica MediaLab). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validación histológica postmortem de la localización de la sonda de prisma y expresión de GCaMP. ( A ) Sección coronal de un cerebro de ratón representativo que muestra el tramo de la sonda prismática y con su lado de formación de imágenes enfrentadoLas células que expresan GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f expresadas en neuronas en las capas 2/3 y 5). ( B ) La misma sección coronaria cerebral después de la tinción para DAPI. Barra de escala = 250 μm ( C ) Visualización ampliada de las células que expresan GCaMP6f en la corteza somatosensorial. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: La actividad del ratón durante la habituación, la familiarización y la prueba de exposición de objetos noveles fue rastreada mediante video utilizando software de vídeo. ( A ) El día 1, el animal fue colocado en un campo de comportamiento desprovisto de cualquier objeto (Campo Abierto). ( B ) En los días 2-4, se colocaron los mismos dos objetos texturalmente diferentes (almohadilla de gel y bloque de madera) en la arena (Object FamiLiarización). ( C ) El día 5, uno de los objetos fue reemplazado por un objeto novedoso (bloque de madera con papel de lija) (Novel Object Exposure). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinámica de calcio de capas superficiales y profundas de la corteza somatosensorial de un ratón representativo de imágenes con el microscopio. ( A ) Imagen fusionada de filtros espaciales neuronales (manchas verdes) y proyección de intensidad de fluorescencia media de la grabación del microscopio a través del campo de visión de la sonda prismática. Frontera entre capas supragranulares e infragranulares indicadas por una línea blanca discontinua. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Trazas de calcio de cinco células superficiales y profundas de capa de ejemplo (llena azul y rojo cElls en el panel A), indicando unidades de desviación estándar de fluorescencia siguiendo el análisis de componente principal y independiente. Barra de escala horizontal 50 s y barra de escala vertical 10 SD ( C ) Gráfica ráster de las células de capas superficiales (capas 2/3) y profundas (capa 5) mostradas sobre Campo abierto, Familiarización de objetos y Exploración de objetos noveles. Barra de escala = 100 s. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K vistas.  Inscopix Inc..  Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada. 

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Investigación

Comportamiento

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biología

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Neurociencias

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Imágenes de calcio de dos fotones y de campo amplio en el colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor destacado: Desvelando la codificación neuronal y los mecanismos de procesamiento visual en el colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Ca Cortical Multi-capa

Resumen

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Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

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