Name: a versatile method of patterning proteins and cells
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
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Los fondos para esta investigación fue proporcionado por la Comisión de New Jersey en la médula espinal de Investigación (NJCSCR) (a FHK), otorgar CSCR14IRG005 (a BLF), NIH subvención R15NS087501 (a CHC), y la Fundación FM Kirby (a ETA).

NOTA: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Algunos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas (campana de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) cuando se utilizan materiales tóxicos o ácido / base. 1. La fabricación de moldes maestros para litografía blanda usando fotolitografía <ol><li> Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD). </li><li> Imprimir el diseño en una placa de máscara en blanco utilizando el escritor máscara láser. </li><li> Enjuagar una oblea de silicio de 4 pulgadas con acetona seguido por isopropanol y secar con una pistola de aire de nitrógeno para asegurar que ningún disolvente se deja en la oblea. </li><li> Deshidratar la oblea por cocción en una placa caliente a 200 ° C durante 5 min. </li><li> Seleccionar un fotorresistente negativo diseñado para la altura deseada de los microcanales. Fo ejemplo, utilizar fotoprotector negativo SU-8 50 para obtener microcanales con una altura de 50 m. </li><li> Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, y luego alinear la oblea en el plato de una recubridora de rotación. </li><li> Dispensar 4 ml (1 ml de diámetro / pulgada de la oblea) de resina fotosensible negativa sobre el centro de la oblea. </li><li> Girar la capa de la oblea con un ciclo de centrifugado en dos fases utilizando una ruleta. En primer lugar, aplicar un ciclo de propagación de 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s. A continuación, aplicar un ciclo de centrifugado de 2000 rpm con una aceleración de 300 rpm / s 2 durante 30 s para obtener un revestimiento 50 micras de material fotorresistente sobre una oblea. </li><li> hornear la oblea suave en dos pasos en un plato caliente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 6 minutos y luego la rampa inmediatamente la temperatura de la placa caliente a la post-hornear la oblea a 95 ° C durante 20 minutos. </li><li> Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y después cargue ella oblea en el escenario litografía. </li><li> Alinear la máscara sobre la oblea usando alineador de máscara y exponer la oblea a la luz UV (según las instrucciones del fabricante) a una intensidad de 1,5 mW / cm 2 para 146 s para aplicar la dosis total de UV de 220 mJ / cm 2 requerida para una 50 m de espesor de capa de resina fotosensible. </li><li> Aplicar horneado posterior a la exposición a la oblea en dos pasos sobre una placa caliente. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min e inmediatamente la rampa encima de la temperatura de la placa caliente a la post-hornear a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Desarrollar la oblea en sumergiendo la oblea en el SU-8 desarrollador y agitando suavemente hasta que las funciones se aclaran en la oblea. Desarrollar la oblea de ~ 6 min para la fotoprotección de espesor de 50 micras. </li><li> Enjuague el exceso de revelador con isopropanol y etanol, y luego secar la oblea con una pistola de aire de nitrógeno. </li><li> Duro hornear la oblea de silicio sobre una placa caliente a 150 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar eloblea en un desecador con 25 l de agente de silanización tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano. NOTA: El agente de silanización es corrosivo, por lo tanto se debe utilizar en una campana de extracción ácido / base, con el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos). </li><li> Aplicar el vacío durante 5 min y exponer la oblea a los vapores de silano durante 30 min sin liberar el vacío. </li><li> La transferencia de la oblea en una placa de Petri de tamaño adecuado. </li></ol> 2. La fabricación de moldes maestros para litografía suave con cinta adhesiva <ol><li> Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo CAD e imprimir el dibujo sobre papel blanco. </li><li> Limpiar un portaobjetos de vidrio lo suficientemente grande para acomodar el diseño con isopropanol y luego secar el portaobjetos con una pistola de aire. </li><li> Pegue cinta adhesiva sobre el portaobjetos de vidrio limpia. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire. </li><li> Cinta de los lados de la glass deslice sobre el papel con el diseño, con la cinta hacia arriba. </li><li> Utilizar un bisturí para cortar la cinta en el portaobjetos de vidrio utilizando el diseño de papel como referencia y luego pelar la cinta de áreas no deseadas de la lámina de vidrio. </li><li> Enjuague el portaobjetos de vidrio con isopropanol y luego se seca con una pistola de aire. Hornear el portaobjetos de vidrio en un horno a 65 ° C durante 30 min. </li><li> rodar suavemente sobre la cinta con un rodillo de goma para eliminar las burbujas de aire y permitir que la corredera se enfríe a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Fabricación suave Litografía de los dispositivos PDMS <ol><li> Mezclar PDMS elastómero y su agente de curado en una relación de 10: 1 (w: w), se agita la mezcla vigorosamente, y luego desgasificar la mezcla colocándolo en una cámara de vacío hasta que no aparecen burbujas de aire en la mezcla. </li><li> Verter la mezcla en un molde de silicona del molde silanizado o cinta adhesiva en una placa de Petri para obtener un ~ 2 gruesa capa de PDMS y desgasificar mm hasta que todo el aire de las burbujas desaparecen. </li><li> Curar el PDMS en un hornoa 65 ° C durante 2 h. </li><li> Utilizar un bisturí para cortar la capa de PDMS al menos 5 mm de distancia de las características y luego pelar el PDMS curado fuera del molde usando pinzas. </li><li> Perforar un único orificio de entrada con una biopsia de 1 mm está en cualquier parte del microcanal, preferiblemente en el extremo de una red de microcanales como se ve en la Figura 2a y 4b. </li><li> Limpiar el PDMS emitidos con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adsorbidos en el dispositivo. Esterilizar el dispositivo de microcanales PDMS (PDMS fundido) de un enjuague con una solución de etanol al 70% seguido de agua desionizada estéril (DI), y exponer a los rayos UV durante 30 min. </li><li> Mantenga el dispositivo PDMS estéril en una placa de Petri estéril hasta su uso. </li></ol> 4. Sustrato Patrones <ol><li> Coloque el PDMS estériles emitidos con unas pinzas sobre un cubreobjetos de vidrio estéril o placa de Petri y aplicar una suave presión con la punta de las pinzas. NOTA: El molde de PDMS realiza una conformación sello pero reversible con el glcubreobjetos culo o placa de Petri que forma microcanales sin el uso de ningún adhesivo. </li><li> Colocar una gota (20 - 40 l) de la solución de sustrato en la entrada que cubre completamente el orificio de entrada. Modelo de poli-D-lisina (PDL) mediante la colocación de una gota de 20 l de PDL en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales. </li><li> Poner la placa de Petri en un vacío de ~ 254 mmHgA (equivalente a vacío de la casa en laboratorios biológicos) durante 10 min, y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. </li><li> Liberar el vacío y observar la solución de sustrato que fluye en el microcanal. </li><li> Incubar el plato en las condiciones apropiadas para la adhesión sustrato. Ver las Tablas 1 y 2 para las condiciones de incubación (estos varían dependiendo del sustrato). Para PDL patrón, se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> cuidadosamente retire el sello de PDMS con unas pinzas estériles y se lava el patrón sobre cubreobjetos tres veces con agua DI. </li&gt; <li> Añadir una solución de 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a la placa de Petri para cubrir el plato o el cubreobjetos de vidrio y se incuba durante la noche a 37 ° C. NOTA: Esto reducirá la adherencia no específica en las regiones no recubiertas. </li><li> Aspirar la solución de BSA al 1%, y el sustrato modelado ya está listo para usar. </li></ol> 5. Patrones indirecta de células <ol><li> Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 1. </li><li> Añadir la suspensión de células a la placa de Petri con dibujos y sumergir completamente la región modelada en suspensión de células. </li><li> Incubar la placa de Petri a 37 ° C en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se unan al sustrato modelado. </li><li> Aspirar el exceso de suspensión de células de la placa de Petri y se lavan las células con dibujos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras agitando suavemente durante 10 s para eliminar las células no unidas. </li><li> Añadir la unamedio de cultivo apropiadas, con a los cultivos celulares con dibujos y se incuban las células con dibujos a 37 ° C en una incubadora de CO 2. </li></ol> 6. Patrones directa de las células NOTA: Esta técnica es una alternativa a los patrones de células indirecto descrito en la etapa 5. Sin embargo, a diferencia de en el paso 5, en esta técnica las células se modelan en las superficies de cultivo de tejidos con o sin recubrimiento de sustrato. <ol><li> Esterilizar el dispositivo microfluídico de un enjuague con una solución de 70% de etanol seguido de agua DI. </li><li> Remojar el dispositivo durante la noche en una solución de 1% de BSA para evitar la adhesión celular a los PDMS. </li><li> Secar el dispositivo a temperatura ambiente y adjuntarlo a la parte inferior de la placa de Petri tratada con cultivo de tejidos. </li><li> Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 2. </li><li> Colocar una gota (4-8 l) de la suspensión celular, suficiente para llenar elmicrocanales, en la entrada que cubre por completo el orificio de entrada. </li><li> Poner la placa de Petri en un vacío de 10 min y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. Liberar el vacío y observar la suspensión de células que fluye en el microcanal. </li><li> Incubar la placa de Petri en una incubadora para promover la adhesión de células como por las condiciones de incubación (dependerá de tipo de célula de modelado) mencionados en la Tabla 2. Añadir PBS a la placa de Petri sumergir el dispositivo de PDMS. </li><li> Pelar el PDMS con cuidado la placa de Petri con pinzas y lavar el patrón con PBS. Añadir medio de cultivo celular a la placa de Petri y colocar el cultivo de células en la incubadora. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Mientras que la fotolitografía convencional es una técnica bien establecida para la realización de moldes de litografía blanda, el equipo, los materiales y las habilidades necesarias para utilizar la fotolitografía convencional no están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios. Para los laboratorios que no tienen acceso a estos recursos, hemos presentado la fabricación de cinta adhesiva como un método de creación de moldes con características relativamente simples para dispositivos de microfluidos. Este método permite que cualquier laboratorio para crear y utilizar dispositivos de microfluidos para fines de investigación con herramientas fácilmente disponibles. El método de la cinta adhesiva puede mejorarse con un bajo costo cortadora de vinilo de escritorio 31. cortadoras de vinilo de escritorio pueden aumentar la reproducibilidad, la resolución, así como la complejidad de diseño. Cada una de estas opciones, fotolitografía convencional, cortadoras de escritorio, o de fabricación de cintas adhesivas tienen diferentes capacidades y limitaciones y los investigadores deben considerar cuidadosamente qué método sería suficientepara sus necesidades. En PDMS curado, las cadenas poliméricas largas de dimetil siloxano forman una celosía, la estructura nanoporoso que crea regiones vacías que pueden ser llenados con las moléculas de aire 27. Esta propiedad es permeable a los gases clave de nuestra forma de proveer los canales de microfluidos. Cuando se coloca en un entorno de baja presión, las moléculas de aire se eliminan del material a granel PDMS, así como los propios 25 microcanales. Cuando el PDMS se expone entonces a la presión atmosférica, el material y microcanales mayor PDMS retienen una presión negativa durante un tiempo 25, 30. Esta presión negativa extrae líquido en los microcanales de llenado automáticamente los canales de microfluidos. Esta presión negativa sigue atrayendo líquido en el canal hasta el PDMS a granel se equilibra con la presión atmosférica. Esta técnica asistida por vacío permite patterning de proteínas y sustratos específicos sobre un sustrato de crecimiento. En este estudio, hemos sido capaces de patrón de varios sustratos diferentes y tipos de células, tanto directa como indirectamente (Tabla 1 y 2). Sin embargo, el experimentador puede necesitar para probar diferentes tiempos de incubación, las densidades de células o medios de siembra para su tipo de célula particular. Estas variables probablemente se refieren a la capacidad innata de cualquiera de la célula o sustrato para adherirse a la superficie que está siendo colocado sobre. Por ejemplo, aquí C2C12 células requieren el uso de medios libres de suero para los medios de comunicación antes de la siembra de cultivo de las células en DMEM con suero de caballo al 2%. Además, las condiciones pueden variar dependiendo de si se está modelada un cubreobjetos de vidrio o placa de Petri de plástico. Aquí, tanto funcionó bien para permitir el patrón específico de diversos tipos de células. Una de las preocupaciones iniciales que hemos probado la utilización de esta técnica fue como exposición al vacío podría afectar la viabilidad celular. Este estudio y pestudios de la mera existencia, sin embargo, deben aliviar estas preocupaciones como hemos demostrado que el vacío tiene poco o ningún efecto en una variedad de células 30. Wang et al. previamente utilizado desgasificada irreversiblemente cámaras selladas de microfluidos para cargar células HeLa 32. Otros estudios han utilizado la siembra de células asistida por vacío para una variedad de tipos de células incluyendo las células madre humanas, las células adherentes y no adherentes, y la línea celular híbrida de hámster humano (A L) de las células de carga en los canales microfluidos 33. Además, otros investigadores han sometido las células a presiones de vacío mucho mayor en comparación con este estudio con poco o ningún efecto discernible sobre las células 33. Las burbujas que se forman durante la eliminación de aire de los microcanales tienden a congregarse en la superficie de la gota de la suspensión en la entrada. A menudo, estas burbujas no se rompen debido a la tensión superficial de la suspensión. No hemos OBSERVed una disminución notable en la viabilidad celular debido a burbujas. Además, el experimento con calceína-AM no sugiere una disminución significativa de la viabilidad celular. Debido a esto, no hemos examinado a fondo la muerte celular específicamente debido a las burbujas. Los intentos anteriores para sustratos patrón o células a menudo se ven afectadas por problemas tales como la formación de burbujas de aire en los dispositivos de microfluidos. La formación de burbujas de aire hacía difícil inyectar líquidos fácilmente y eficientemente sin el uso de equipos o materiales que no están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Por ejemplo, los métodos anteriores utilizan el uso de tratamiento con plasma o tratamiento corona para disminuir la hidrofobicidad de microcanales PDMS 15, 34. Aunque son eficaces, plasma y tratadores corona no están fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. En este protocolo, se demuestra la capacidad de las células de patrón y el simple uso de sustratos labora comúnaspiradoras tory. Utilizando la técnica de fabricación de cinta adhesiva, la metodología se puede utilizar para crear canales de microfluidos PDMS a sustratos patrón o células en casi cualquier laboratorio. Con el fin de sustratos patrón o células con el protocolo patrón de vacío, varios pasos son críticos para el patrón de éxito. En primer lugar, para fabricar el maestro de cinta adhesiva, la cinta adhesiva debe estar bien conectado a la placa de vidrio y libre de burbujas de aire. Las burbujas de aire debilitar la unión entre la cinta y el portaobjetos de vidrio y puede conducir a la cinta se desprendan una vez curado PDMS se despega del molde cinta adhesiva. Además, las burbujas de distorsionarán la geometría del canal de microfluidos haciendo que la superficie de los canales para ser no plana. Para hacer que el PDMS emitidos, de SU-8 molde, el molde SU-8 debe ser silanizada antes de la colada con PDMS. Este paso es crítico en la prevención de la unión permanente de PDMS al molde SU-8 después del curado de PDMS. Antes de sellar conformaldel canal de microfluidos PDMS a cubreobjetos de vidrio o placas de Petri de plástico, el PDMS se deben limpiar de todas las partículas de polvo. Estas partículas pueden prevenir la formación de un sello de conformación entre PDMS y de vidrio y por lo tanto evitar que la inyección de células o sustratos en el canal microfluídico. Como se indica en el protocolo anterior, la limpieza de los canales de PDMS con cinta adhesiva es crítica antes de adherir el microcanal a cubreobjetos de vidrio o placas de Petri de plástico. Finalmente, después de colocar el dispositivo en la cámara de vacío, el vacío debe ser liberado con cuidado para evitar el desplazamiento de la gota de sustrato o célula solución desde el orificio de entrada. Si no se observa fluido que fluye en el canal microfluídico, puede haber una fuga en el canal microfluídico que evitar que el líquido que fluye en el canal. Retire el sello de PDMS, seco y limpiarlo y luego repetir el paso 4, 5 ó 6 de la técnica. Si la solución no fluye en el microcanal después de release de vacío, asegúrese de que la solución cubra completamente la entrada del microcanal. Esto se puede hacer por la solución pipeteando arriba y abajo varias veces mientras que pone en el orificio de entrada. Si el sustrato, después de la inyección en el microcanal, no adjuntar al vidrio, evaluar y determinar las condiciones óptimas de incubación necesarios para el sustrato utilizado. Si la eliminación de los PDMS emitidos desde la superficie de vidrio o placa de Petri de plástico hace que las células o sustratos estructurados para ser destruidas, utilizar un molde PDMS más delgada, sumergir los PDMS emitidos en PBS o medios de comunicación, y lenta y suavemente pelar los PDMS emitidos desde el cristal o superficie de plástico con unas pinzas. Finalmente, BSA puede ser crítico en la disminución de la adhesión no específica de las células para el cristal de unpatterned o superficie de plástico. BSA se utiliza típicamente como un reactivo de bloqueo en el Western Blot, inmunotinción, y otras técnicas de biología molecular. Otros investigadores también han utilizado durante indirecta o directaprotocolos de modelado para reducir la adhesión celular no específica 35, 36, 37. Se encontró que la incubación del sustrato con BSA era necesario para la mayoría de tipos de células con excepción de las células de la retina salamandra. Esto puede ser debido a la naturaleza más especializada del sustrato (un anticuerpo llamado Sal-1) que se usó, así como la falta general de la adhesión celular por este tipo de células 38. En nuestras manos, BSA también no disminuyó notablemente la adherencia de las células a las zonas estampadas y sobre todo sirve para disminuir la adherencia no específica. Si bien este método está diseñado para ser versátil y flexible en su aplicación a diferentes tipos de sustrato y células, existen varias limitaciones a este protocolo y las células compatibles y el sustrato. Debido a la naturaleza misma de modelando las células sobre una superficie, los tipos de células que esta técnica se puede aplicar a se limitan a thoSE, que son susceptibles de cualquier protocolo de patrones tales como aquellas células que son capaces de sobrevivir con más células limitado al contacto celular, así como los que pueden sobrevivir a concentraciones de células de siembra más bajas. Por ejemplo, una aplicación potencial es el patrón de células de levadura para microscopía de fuerza atómica (AFM) 39. Si bien hemos probado diversos sustratos celulares, otros sustratos no pueden trabajar con esta técnica en particular tales como los que forman geles tridimensionales. En este momento, no hemos examinado si los geles se forman adecuadamente y se quedan en la superficie del cubreobjetos de vidrio o placa de Petri de plástico después de patrones. Esta técnica es capaz de modelando formas complejas y grandes superficies. Sin embargo, no puede patrón de una gran variedad de formas separadas individuales sin interconexión de microcanales. En ausencia de microcanales interconectados, cada uno de forma individual pudiera requerir su propia entrada de toma de la técnica engorroso. Aunque no vimos ninguna falta de uniformidad en patterning de proteínas, la distribución de células modelado dentro del microcanal puede ser no uniforme. Esta falta de uniformidad puede ser debido a la distribución aleatoria de las células en suspensiones celulares, la geometría y dimensiones de los microcanales, y la viscosidad de la suspensión de células. En el futuro, esta técnica se puede aplicar a otros tipos de sustratos y células. Por ejemplo, los geles tridimensionales tales como la matriz de la membrana basal o andamios de colágeno potencialmente pueden ser estampadas y forman utilizando PDMS canales de microfluidos. Mediante la inyección de un hidrogel en el dispositivo microfluídico, el hidrogel puede tomar en la forma del dispositivo de microfluidos y ser capaz de formar patrones complejos sin el uso de impresoras 3-D u otras tecnologías. Estos permitirían la rápida creación de andamios estructuradas con herramientas fácilmente disponibles y dispositivos de microfluidos.

En la ingeniería de tejidos y biosensores, la capacidad de controlar la organización espacial de las proteínas y células en una escala de micras, se ha convertido cada vez más importante en los últimos cuatro décadas 1, 2, 3. Organización espacial precisa de las proteínas y células ha permitido a los investigadores examinar la interacción entre las células y sustratos que contienen tipos similares o diferentes de células, para guiar el crecimiento celular, y para inmovilizar biomoléculas para la fabricación de biosensores 4, 5, 6, 7, 8, 9. Los métodos actuales de proteínas de modelado incluyen photopatterning y la impresión por microcontacto. Photopatterning utiliza material sensible a la luz que se entrecruza con la exposición a ultruna violeta (UV). Luz UV dirigida a una fotomáscara (que consta de zonas transparentes con regiones más oscuras para prevenir la transmisión de luz UV) provoca reticulación en regiones específicas que luego se pueden utilizar para la unión subsiguiente de los biomateriales o células 10, 11. Aunque este esquema es muy precisa y permite un control preciso de la topografía de la superficie de cultivo, que se limita a biomoléculas sensibles a UV que pueden ser modeladas por la radiación UV 12. La impresión por microcontacto es otro método popular de proteínas específicas modelando 13, 14. En este método, un siloxano (PDMS) sello de poli-dimetil se trata con una variedad de reactivos de modificación de la superficie antes de ser sumergida en una solución del sustrato biomolecular elegido. A continuación, se presiona suavemente sobre un cubreobjetos de vidrio u otra superficie de este modo el &quot;sacrificio&quot; de la biomolécula sobre la superficie de cultivo. HoWever, estampado se limita al tipo de material que puede ser transferida, así como la humectabilidad de las biomoléculas a la superficie de los PDMS sello 15. Patrón directa de las células puede ser más difícil y se basa en métodos complejos tales como sustratos conmutables, métodos basados en la plantilla, o patrones con las moléculas de adhesión celular específicos 16, 17. Estos métodos están limitados en su capacidad de células de patrón debido a la falta de sustratos de adhesión celular compatibles, incompatibilidad de que el proceso funcione con células sensibles biológicos y limitaciones, la inconsistencia en la reproducción del patrón, y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, con sustratos conmutables, sustratos personalizados necesitan ser diseñadas para cada tipo de célula, para cambiar su adhesión a tipos celulares específicos sin la degradación a la exposición a la luz UV y calor usado en proceso 17, &lt;<html> SUP = &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20. procedimientos de modelado en base de la plantilla son versátiles en su capacidad de células de patrón; sin embargo, es difícil de fabricar plantillas de PDMS en los espesores adecuados para uso 16, 21. La inyección directa de células en los canales de microfluidos PDMS tiene algunas ventajas, tales como: 1) la facilidad de fabricación de canales de microfluidos y 2) de idoneidad para muchas células y sustratos diferentes. Sin embargo, el problema frecuente de la captura de burbujas de aire durante el proceso de inyección debido a la hidrofobicidad de PDMS sin el uso de limpieza de plasma, u otros métodos para reducir las burbujas de aire, hace que sea difícil crear consistentemente células modelados en el vidrio o de plástico superficies 21. Este trabajo amplía micromoldeo capilar 22, 23,lass = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26 y reporta un método para inyectar proteínas celulares y suspensiones en microcanales. El método utilizado aquí demuestra el patrón de sustratos y ambos patrones directa e indirecta de determinados tipos de células. Esta técnica supera la alta hidrofobicidad de PDMS y elimina la presencia de burbujas durante la inyección de cualquiera de los sustratos o las células mediante el aprovechamiento de la permeabilidad al gas de PDMS 27. Este documento muestra el uso de la técnica con varios sustratos diferentes y tipos de células. El artículo también destaca la fabricación de moldes para la litografía blanda usando fotolitografía convencional, así como un adhesivo simple y de bajo costo método de la cinta útil en entornos con recursos limitados 28, 29.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device</td></tr><tr><td>Laser Printer HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Used to degass the PDMS mixture</td></tr><tr><td>Adhesive Scotch Tape</td><td>3M Product, MN</td><td>Tape 600</td><td>Used to fabricate adhesive tape Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Casting polymer</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Used to keep the mold to cast with PDMS</td></tr><tr><td>Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>Used to cut the PDMS</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Used to handle the PDMS cast during peeling</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Rubber Roller</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Germany</td><td>DWL66fs</td><td>Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Used to expose the photoresist to UV light</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Used to spin coat the photoresist on silicon wafer</td></tr><tr><td>Photoresists SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Negative photoresist used for mold fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Coat mold to avoid PDMS adhesion</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Cleaning Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Sterilization Solvent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminin aliquoted into 10 &amp;micro;L aliquots and diluted to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;L in PBS prior to use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Used to demonstrate C2C12 patterning</td></tr><tr><td>PC12 Cell Line</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Used to demonstrate PC12 patterning</td></tr><tr><td>Collagen type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Horse Serum, heat inactivated</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>To label cells</td></tr><tr><td>Calcein-AM live dead cell Assay kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Cell viability Assay</td></tr><tr><td>Biopsy Hole Punch</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Punched hole in PDMS</td></tr></tbody></table>

a versatile method of patterning proteins and cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Este método permite que el patrón de proteínas y patrones indirecta de células usando sin salida canales de microfluidos con dimensiones tan pequeñas como 10 micras y equipo disponible en casi todos los laboratorios biológicos una vez que se hizo el molde maestro. Esta técnica se puede utilizar con los canales de microfluidos PDMS creados usando fotolitografía tradicional suave, o con canales de microfluidos PDMS creadas con cinta adhesiva de fabricación (Figura 1) 28, 29. Hemos demostrado previamente la utilización de este procedimiento en el patrón indirecta de las células neuronales para la evaluación de guiado de los axones en los fotorreceptores 4, 30, y ahora han demostrado su uso en varios tipos de células adicionales de diferentes orígenes. de embriones de rata neuronas corticales estampadas en el poli-D-lisina (PDL) y laminina superficies demuestran adherenc generale para las áreas estampadas y el crecimiento a lo largo del PDL y rayas laminina (Figura 3A). Líneas celulares de mioblastos C2C12 también se adhieren a la zona de modelado y demuestran de fusión en miotubos multinucleados (Figura 3B). También hemos adaptado esta técnica de modelado directo de células como se ha visto con los fibroblastos en la Figura 4. Como se informó anteriormente, este método patrón celular directa no mostró ningún efecto adverso sobre la supervivencia de las células 30. Las variables que conducen a un éxito patrones directa o indirecta de los tipos de células indicadas se enumeran en la Tabla 1 y 2. Así, en el futuro, los investigadores pueden utilizar esta técnica para células de patrón y descubrir los fenómenos relacionados con su patrón específico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig1.jpg" /> Figura 1: La fabricación del molde mediante litografía blanda. Izquierda: Fotolitografíay proceso. SU-8 es revestimiento por centrifugación sobre una oblea de silicio, expuesta a la radiación UV, y desarrollado para eliminar el exceso de SU-8. Derecha: Adhesivo proceso de fabricación de la cinta. Cinta adhesiva se une a un portaobjetos de vidrio limpio, se cortó con un escalpelo, y el exceso de cinta se retira cuidadosamente. PDMS fundido se fabrica a continuación, a partir de cada molde usando litografía blanda. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplo de un dispositivo de PDMS para Sustrato Patrones. (A) PDMS reparto de microfluidos con una entrada utilizada para el patrón de microfluidos de sustratos. De entrada fue perforado en un extremo de microcanales. (B) del canal de microfluidos como se ve en el microscopio de contraste de fase. canales de microfluidos son 15 mm de longitud, 20 m de ancho, unad separados por 200 m. La figura 2 se reproduce con permiso de IOP Publishing. Todos los derechos reservados 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig3.jpg" /> Figura 3: Patrón de la célula indirecta. (A) de vacío asistida proceso de modelado de proteínas. PDMS dispositivo de canal microfluídico está unido a una placa de Petri, solución de sustrato se carga en la entrada, se aplica vacío a la cámara brevemente y se suelta, se elimina dispositivo de PDMS, patrón se lava, y listo para usar. (B) neuronas de rata corticales embrionarias sembraron sobre un cubreobjetos con un sustrato PDL y laminina con patrón. Líneas (c) C2C12 mioblastos cultivados en células PDL con dibujos y laminina. Las figuras 3a y 3c se reproducen con permission de IOP Publishing. Todos los derechos reservados 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig4.jpg" /> Figura 4: Patrón teléfono directo. (A - c) Los fibroblastos modeladas a través del patrón celular directa. (A) Dispositivo de canal de microfluidos fabricado utilizando la litografía cinta adhesiva. (B) los canales de microfluidos después del llenado con la suspensión celular de fibroblastos utilizando asistida por vacío técnica de modelado. (C) Los fibroblastos después de la eliminación del dispositivo de microfluidos. (D) La calceína-AM tinción de los fibroblastos después de patrones de microfluidos. contraste de la imagen (e) Fase de fibroblastos después de los patrones de microfluidos. (F - g </strong&gt;) Los fibroblastos teñidas con faloidina-TRITC (rojo) y DAPI (azul). Figura 4 se reproduce con permiso de IOP Publishing. Todos los derechos reservados 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> El modelado de la célula indirecta </td><td> sustrato </td><td> Condiciones de incubación de proteínas </td><td> La densidad celular </td><td> Adhesión Celular Duración </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> Colágeno-1 </td><td> 1 hora a 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / ml </td><td> 1 hora a 37 ° C </td></tr><tr><td> fibroblastos </td><td> Colágeno-1 </td><td> 1 hora a 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / ml </td><td> 1 hora a 37 ° C </td></tr><tr><td> C2C12 </td><td> PDL + laminina </td><td> 1 hora a 37 ° C, se lavan PBS, durante la noche a 37 ° C </td><td> 2 x 10 6 / mL </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Embrionarias de rata neuronas corticales </td><td> PDL + laminina </td><td> 1 hora a 37 ° C, se lavan PBS, durante la noche a 37 ° C </td><td> 2 x 10 6 / mL </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Las neuronas de la retina salamandra </td><td> Sal-1 </td><td> durante la noche a 10 ° C </td><td> N / A </td><td> 1 hora a 10 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Condiciones indirectos Patterning celular. Lista de condiciones de incubación, tales como el tipo de sustrato, el tiempo, la temperatura y la densidad de células para tipos de células típicas. Los investigadores deben optimizar las condiciones de incubación para sus propios sustratos modelo y tipo de células. Sal-1 es el sustrato de anticuerpos utilizadas para el cultivo Salamander neuronas de la retina. <table border=&quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> El modelado directo de la célula </td><td> sustrato </td><td> La densidad celular </td><td> Tiempo de adhesión de la célula </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> Colágeno-1 </td><td> 6 x 10 6 / mL </td><td> 1 hora a 37 ° C </td></tr><tr><td> fibroblastos </td><td> Colágeno-1 </td><td> 6 x 10 6 / mL </td><td> 1 hora a 37 ° C </td></tr><tr><td> C2C12 </td><td> PDL + laminina </td><td> 2 x 10 6 / mL </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Embrionarias de rata neuronas corticales </td><td> PDL + laminina </td><td> 2 x 10 6 / mL </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Las neuronas de la retina salamandra </td><td> Sal-1 </td><td> N / A </td><td> 1 hora a 10 ° C </td></tr></tbody></table>Tabla 2: Condiciones Patterning celular directa. Lista de condiciones de incubación tales como temperatura, tiempo, y la densidad de células para tipos de células típicas. Los investigadores deben optimizar las condiciones de incubación para su propio tipo de célula modelo.

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A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K vistas.  Rutgers University. This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Video: A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Biología

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Mapeo de la Organización Espacial Emergente de Células De mamíferos usando Micropatrones e Imágenes Cuantitativas

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Biología del Desarrollo

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparación de microambientes de matriz extracelular sintonizable para evaluar la especificación del fenotipo celular Schwann

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...