Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dalla Commissione del New Jersey su Spinal Cord Research (NJCSCR) (a FHK), concedere CSCR14IRG005 (a BLF), NIH concedere R15NS087501 (a CHC), e la Kirby Fondazione FM (ETA).

NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base. 1. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia mediante fotolitografia <ol><li> Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno computer-aided design (CAD). </li><li> Stampa il layout su un piatto maschera vuoto utilizzando la maschera laser scrittore. </li><li> Risciacquare un wafer di silicio da 4 pollici con acetone mediante isopropanolo e asciugare con una pistola ad aria azoto per garantire che nessun solvente viene lasciato sul wafer. </li><li> Disidratare wafer mediante cottura su una piastra calda a 200 ° C per 5 min. </li><li> Selezionare un fotoresist negativo progettata per l&#39;altezza desiderata dei microcanali. Fo esempio, utilizzare fotoresist negativo SU-8 50 per ottenere microcanali con un&#39;altezza di 50 micron. </li><li> Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente, e quindi allineare il wafer sul mandrino di coater rotazione. </li><li> Dispensare 4 ml (1 mL diametro / pollice della fetta) di fotoresist negativo sul centro della fetta. </li><li> Spin cappotto il wafer con un ciclo di centrifuga in due fasi utilizzando un filatore. Innanzitutto, applicare un ciclo di diffusione di 500 rpm con un&#39;accelerazione di 100 rpm / s per 10 s. Quindi applicare un ciclo di centrifuga di 2000 giri con un&#39;accelerazione di 300 rpm / s 2 per 30 s per ottenere un rivestimento 50 micron di photoresist su un wafer. </li><li> Morbido cuocere il wafer in due fasi su un piatto caldo secondo le istruzioni del produttore. Per un rivestimento 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 6 minuti e poi subito rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere il wafer a 95 ° C per 20 min. </li><li> Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente e quindi caricare ilwafer sul palco litografia. </li><li> Allineare la maschera sul wafer utilizzando maschera allineatore ed esporre la fetta di luce UV (come da istruzioni del produttore) ad una intensità di 1,5 mW / cm 2 per 146 s per applicare la dose totale UV di 220 mJ / cm 2 necessario per un 50 micron di spessore strato di resina fotosensibile. </li><li> Applicare dopo l&#39;esposizione cuocere al wafer in due fasi su un piatto caldo. Per un rivestimento di 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min e immediatamente rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere è a 95 ° C per 5 min. </li><li> Sviluppare il wafer in immergendo il wafer di SU-8 sviluppatore e scuotendo delicatamente fino a quando le caratteristiche diventano chiari sul wafer. Sviluppare il wafer per ~ 6 min per il photoresist spessore 50 micron. </li><li> Risciacquare eccesso sviluppatore con isopropanolo ed etanolo, quindi asciugare il wafer con una pistola ad aria azoto. </li><li> Duro cuocere il wafer di silicio su una piastra calda a 150 ° C per 15 min. </li><li> Posiziona ilwafer in un essiccatore con 25 ml di agente silanizzazione tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano. NOTA: L&#39;agente silanizzazione è corrosivo, quindi dovrebbe essere utilizzato in un cappa acido / base, con attrezzature adeguate di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe). </li><li> Applicare il vuoto per 5 minuti ed esporre il wafer ai vapori di silano per 30 minuti senza rilasciare il vuoto. </li><li> Trasferire il wafer in una capsula di Petri opportunamente dimensionato. </li></ol> 2. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia con nastro adesivo <ol><li> Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno CAD e stampare il disegno su carta bianca. </li><li> Pulire un vetrino abbastanza grande per ospitare il disegno con isopropanolo e poi asciugare il vetrino con un fucile ad aria. </li><li> Attaccare il nastro adesivo sul vetrino pulito. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Nastro lati della glass scivolare sulla carta con il disegno, con il nastro rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino utilizzando il disegno di carta come riferimento e quindi rimuovere il nastro da aree indesiderate del vetrino. </li><li> Sciacquare il vetrino con isopropanolo e asciugare con un fucile ad aria. Cuocere il vetrino in stufa a 65 ° C per 30 min. </li><li> Delicatamente rotolare sopra il nastro con un rullo di gomma per rimuovere le bolle d&#39;aria e consentire la slitta raffreddare a temperatura ambiente. </li></ol> 3. soft litografia fabbricazione dei dispositivi PDMS <ol><li> Mescolare PDMS elastomero e il suo agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (w: w), agitare la miscela vigorosamente, e quindi degassare la miscela ponendolo in una camera a vuoto fino bolle d&#39;aria vengono visualizzati nella miscela. </li><li> Versare il composto su uno stampo di silicone silanizzata o muffa nastro adesivo in una capsula di Petri per ottenere un ~ 2 spesso strato di PDMS e Degas mm fino a quando tutta l&#39;aria bolle scompaiono. </li><li> Curare il PDMS in un fornoa 65 ° C per 2 h. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS di almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche e poi sbucciate le PDMS curato fuori lo stampo con pinzetta. </li><li> Effettuare un singolo foro di ingresso con una biopsia 1 millimetro punzone ovunque sul microcanali, preferibilmente al termine di una rete di microcanali, come mostrato nella figura 2a e 4b. </li><li> Pulire i PDMS espressi con del nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere adsorbiti sul dispositivo. Sterilizzare il dispositivo microcanali PDMS (PDMS Cast) risciacquando con una soluzione di etanolo al 70% seguita da deionizzata sterile dell&#39;acqua (DI), e esporre a UV per 30 min. </li><li> Tenere il dispositivo PDMS sterile in una capsula di Petri sterile fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. substrato Patterning <ol><li> Posizionare il PDMS sterili espressi con una pinzetta su un vetrino di vetro sterile o capsula di Petri e applicare una leggera pressione con la punta delle pinzette. NOTA: Il cast PDMS fa una conforme, ma tenuta reversibili con la glass vetrino o una scatola Petri formando microcanali senza l&#39;uso di alcun adesivo. </li><li> Posizionare una goccia (20 - 40 ml) della soluzione di substrato sull&#39;ingresso copre completamente il foro di immissione. Motivo Poly-D-lisina (PDL) posizionando una goccia 20 ml di PDL in tampone sodio tetraborato in ingresso dei microcanali. </li><li> Mettere la capsula di Petri in un vuoto di ~ 254 mmHgA (equivalente ad alloggiare vuoto in laboratori biologici) per 10 minuti, e osservare l&#39;aria che esce dal canale nella forma di bolle. </li><li> Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione di substrato che scorre nel microcanali. </li><li> Incubare il piatto alle condizioni adeguate per il substrato aderenza. Vedere Tabelle 1 e 2 per le condizioni di incubazione (questi variano a seconda del substrato). Per PDL patterning, incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> sbucciare con cautela il timbro PDMS con una pinzetta sterile e lavare il modello sul vetrino di vetro tre volte con acqua deionizzata. </li&gt; <li> Aggiungere una soluzione 1% di siero albumina bovina (BSA) per capsula di Petri per coprire il piatto o vetro coprioggetto e incubare una notte a 37 ° C. NOTA: Ciò consentirà di ridurre l&#39;aderenza non specifico nelle regioni non rivestiti. </li><li> Aspirare off la soluzione BSA 1% e il substrato modellato è ora pronto per l&#39;uso. </li></ol> 5. Patterning indiretta di celle <ol><li> Preparare la sospensione cellulare in terreno di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere la sospensione cellulare al piatto modellato Petri e sommergere completamente la regione modellata in sospensione cellulare. </li><li> Incubare la piastra di Petri a 37 ° C in un incubatore per 15 minuti per permettere alle cellule di allegare al substrato modellato. </li><li> Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla piastra di Petri e lavare le cellule fantasia tre volte con tampone fosfato (PBS) mentre delicatamente agitazione per 10 s per rimuovere le cellule senza legami. </li><li> Aggiungere l&#39;unamezzo di coltura ppropriate alle colture cellulari fantasia e incubare le cellule modellata a 37 ° C in un incubatore CO 2. </li></ol> 6. Patterning diretta delle cellule NOTA: Questa tecnica è un&#39;alternativa al patterning cella indiretta descritto nel passaggio 5. Tuttavia, a differenza del passaggio 5, in questa tecnica cellule sono modellati su superfici coltura tissutale con o senza rivestimento substrato. <ol><li> Sterilizzare il dispositivo microfluidico risciacquando con una soluzione di 70% di etanolo seguito da acqua DI. </li><li> Immergere il dispositivo notte in una soluzione di 1% BSA per impedire l&#39;adesione cellulare ai PDMS. </li><li> Essiccare il dispositivo a temperatura ambiente e fissarlo al fondo del piatto Petri coltura di tessuti trattati. </li><li> Preparare la sospensione cellulare in terreni di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 2. </li><li> Inserire una gocciolina (4 - 8 ml) della sospensione cellulare, sufficiente a riempire lamicrocanali, sull&#39;ingresso coprendo completamente il foro di immissione. </li><li> Mettere la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti e osservare aria proveniente dal canale in forma di bolle. Il vuoto e osservare la sospensione cellulare scorre nel microcanali. </li><li> Incubare la piastra di Petri in un incubatore per favorire l&#39;adesione delle cellule secondo le condizioni di incubazione (dipende dal tipo di cellula modellata) indicato nella Tabella 2. Aggiungere PBS alla capsula di Petri immergendo il dispositivo PDMS. </li><li> Sbucciare la PDMS con cautela la capsula di Petri con una pinzetta e lavare il modello con PBS. Aggiungere terreni di coltura cellulare per la piastra di Petri e posizionare la coltura cellulare in incubatrice. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+with+BSA+blocking+based+on+in+situ+synthesized+gold+nanoparticles+in+poly+(dimethylsiloxane)+microchip.">Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip.</a> Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).</li><li>Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+tumor+marker+in+blood+serum+using+antibody-modified+field+effect+transistor+with+optimized+BSA+blocking.">Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking.</a> Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunoassay+through+in-channel+microfluidic+patterning.">High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).</li><li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro.">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li><li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+chemically+modified+baker's+yeast+cells+studied+by+AFM.">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio per creare e utilizzare dispositivi microfluidici per scopi di ricerca con strumenti facilmente reperibili. Il metodo di nastro adesivo può essere migliorata con un basso costo del vinile del desktop taglierina 31. plotter desktop possono aumentare la riproducibilità, risoluzione, così come la layout complessità. Ognuna di queste opzioni, fotolitografia convenzionale, taglierine del desktop o di fabbricazione del nastro adesivo hanno capacità diverse e limitazioni e ricercatori devono considerare attentamente quale metodo sarebbe sufficienteper le loro esigenze. In PDMS curate, le lunghe catene polimeriche di dimetil silossano formano un reticolo, struttura nanoporosa che crea regioni vuote che possono essere riempiti con le molecole d&#39;aria 27. Questa struttura permeabile a gas è la chiave per il nostro metodo di riempire i canali microfluidica. Quando posto in un ambiente a bassa pressione, le molecole d&#39;aria vengono rimossi dal materiale sfuso PDMS nonché microcanali stessi 25. Quando il PDMS viene quindi esposto alla pressione atmosferica, il materiale sfuso PDMS e microcanali mantengono una pressione negativa per qualche tempo 25, 30. Questa pressione negativa attira liquido nei microcanali riempimento automaticamente i canali microfluidica. Questa pressione negativa continua a disegnare liquido nel canale fino PDMS bulk si equilibra con la pressione atmosferica. Questa tecnica vacuum-assisted permette di patterning di proteine ​​e substrati specifici su un substrato di crescita. In questo studio, siamo stati in grado di modello diversi substrati diversi e tipi di cellule, sia direttamente che indirettamente (Tabella 1 e 2). Tuttavia, lo sperimentatore può avere bisogno di testare diversi tempi di incubazione, densità delle celle, o supporti di semina per la loro particolare tipo di cellula. Queste variabili possono riguardano la capacità innata di una cella o substrato di aderire alla superficie sulla quale viene depositato. Per esempio, ecco C2C12 cellule richiesto l&#39;utilizzo di mezzi senza siero per i mezzi di semina prima coltura le cellule in DMEM con il 2% siero di cavallo. Inoltre, le condizioni possono variare in base alle se un vetrino di vetro o di plastica capsula di Petri è in fase di fantasia. Qui, sia lavorato bene per permettere specifica patterning di vari tipi cellulari. Una delle preoccupazioni iniziali che abbiamo avuto, mentre utilizzando questa tecnica è stata come l&#39;esposizione al vuoto potrebbe influenzare la vitalità delle cellule. Questo studio e pstudi sola esistenza, tuttavia, dovrebbero alleviare tali preoccupazioni, come abbiamo dimostrato che il vuoto ha poco o nessun effetto su una varietà di cellule 30. Wang et al. precedentemente utilizzato degasato irreversibilmente sigillato camere di microfluidica per caricare cellule HeLa 32. Altri studi hanno utilizzato vuoto-assistita semina cellulare per una varietà di tipi di cellule umane, comprese le cellule staminali, cellule aderenti e non aderenti, e linea cellulare ibrido uomo-criceto (A L) cellule caricare in canali microfluidica 33. Inoltre, altri ricercatori hanno sottoposto cellule molto maggiori pressioni di vuoto rispetto a questo studio con poco o nessun effetto rilevante sulle cellule 33. Bolle formatisi durante la rimozione dell&#39;aria dai microcanale tendono a raggrupparsi sulla superficie della goccia della sospensione in ingresso. Spesso queste bolle non rottura a causa della tensione superficiale della sospensione. Non abbiamo Observcato una notevole diminuzione della vitalità cellulare a causa di bolle. Inoltre, l&#39;esperimento con calceina-AM non suggerisce una significativa diminuzione della vitalità cellulare. A causa di questo, non abbiamo esaminato a fondo la morte delle cellule specificamente a causa di bolle. I precedenti tentativi di substrati modello o cellule erano spesso afflitti da problemi quali la formazione di bolle d&#39;aria nei dispositivi microfluidici. La formazione di bolle d&#39;aria ha reso difficile iniettare liquidi semplice ed efficiente senza l&#39;impiego di apparecchiature o materiali che non sono disponibili in molti laboratori. Ad esempio, i metodi precedenti utilizzati l&#39;uso del trattamento al plasma o trattamento corona per diminuire l&#39;idrofobicità di PDMS microcanali 15, 34. Mentre efficace, plasma e dispositivi di trattamento corona non sono facilmente disponibili in molti laboratori. In questo protocollo, dimostriamo la capacità di cellule di pattern e substrati semplicemente utilizzando labora comunevuoti conservatore. Utilizzando la tecnica di fabbricazione del nastro adesivo, il metodo può essere utilizzato per creare PDMS canali microfluidica a substrati modello o cellule in quasi qualsiasi laboratorio. Per substrati modello o cellule con il protocollo patterning vuoto, diversi passaggi sono fondamentali per patterning successo. Innanzitutto, per fabbricare il master nastro adesivo, il nastro adesivo deve essere completamente collegato al vetrino e privo di bolle d&#39;aria. Le bolle d&#39;aria indebolire il legame tra il nastro e la lastra di vetro e può portare al nastro di essere staccata quando curato PDMS è staccata stampo nastro adesivo. Inoltre, bolle falsare la geometria del canale microfluidico causando la superficie dei canali di essere non planare. Per rendere il PDMS espressi dal SU-8 stampo, lo stampo SU-8 deve essere silanizzata prima del getto con PDMS. Questo passaggio è fondamentale nel prevenire l&#39;adesione permanente di PDMS allo stampo SU-8 dopo l&#39;indurimento di PDMS. Prima di tenuta conformazionaledel canale microfluidica PDMS di lamelle di vetro o scatole Petri in plastica, i PDMS devono essere puliti di tutte le particelle di polvere. Queste particelle possono impedire la formazione di una tenuta conforme tra PDMS e vetro e quindi prevenire l&#39;iniezione di cellule o substrati nel canale microfluidica. Come indicato nel protocollo di cui sopra, la pulizia dei PDMS canali con del nastro adesivo è fondamentale prima di aderire il microcanali di coprioggetto di vetro o scatole Petri in plastica. Infine, dopo aver posizionato il dispositivo nella camera a vuoto, il vuoto deve essere rilasciato delicatamente per impedire lo spostamento della goccia di substrato o cella soluzione dal foro di ingresso. Se non si osservano fluido che scorre nel canale microfluidica, ci può essere una perdita nel canale microfluidico che impedirebbe liquido di fluire nel canale. Rimuovere il timbro PDMS, asciutto e pulito e poi ripetere il punto 4, 5, o 6 della tecnica. Se la soluzione non scorre nel microcanali dopo release del vuoto, assicurarsi che la soluzione sia completamente copre l&#39;ingresso del microcanale. Questo può essere fatto pipettando soluzione su e giù parecchie volte mentre metterlo nel foro di ingresso. Se il substrato, dopo aver iniettato nel microcanali, non allegare al vetro, valutare e determinare le condizioni di incubazione ottimali necessarie per il substrato utilizzato. Se la rimozione della PDMS espressi dalla superficie del vetro o capsula di Petri di plastica induce le cellule o substrati fantasia per essere distrutti, utilizzare un cast PDMS più sottile, immergere il PDMS espressi in PBS o supporto, e lentamente e delicatamente staccare il PDMS espressi dal vetro o superficie di plastica con una pinzetta. Infine, BSA può essere critica nel ridurre l&#39;adesione aspecifica delle cellule per il vetro di nanostrutturata o superficie di plastica. BSA è tipicamente usato come reagente bloccante in western blotting, immunostaining e altre tecniche di biologia molecolare. Altri ricercatori hanno anche utilizzato per indiretta o direttaprotocolli di patterning per diminuire l&#39;adesione delle cellule aspecifica 35, 36, 37. Abbiamo scoperto che l&#39;incubazione del substrato con BSA era necessaria per molti tipi di cellule tranne cellule retiniche salamandra. Questo può essere a causa della natura più specializzata del substrato (un anticorpo chiamato Sal-1) che è stato utilizzato, nonché la generale mancanza di adesione cellulare da questo tipo di cella 38. Nelle nostre mani, BSA inoltre, non ha notevolmente diminuire l&#39;adesione delle cellule alle aree fantasia e soprattutto servita a diminuire l&#39;aderenza non specifico. Mentre questo metodo è progettato per essere versatile e flessibile nella sua applicazione ai vari tipi di substrato e cellulari, ci sono diverse limitazioni a questo protocollo e le cellule compatibili e substrato. A causa della natura di patterning cellule su una superficie, i tipi di cellule che questa tecnica può essere applicata a sono limitati a those suscettibili di qualsiasi protocollo patterning come quelle cellule che sono in grado di sopravvivere con più celle limitata a contatto cellula così come quelli che può sopravvivere a concentrazioni cellulari semina inferiori. Ad esempio, una possibile applicazione è il patterning di cellule di lievito per microscopia a forza atomica (AFM) 39. Anche se abbiamo testato molti substrati cellulari diversi, altri substrati potrebbero non funzionare con questa particolare tecnica, come quelle che formano i gel tridimensionali. In questo momento, non abbiamo esaminato se i gel formano correttamente e rimanere sulla superficie del vetrino di vetro o di plastica capsula di Petri dopo patterning. Questa tecnica è in grado di patterning forme complesse e grandi aree. Tuttavia, essa non può modello di una serie di singole forme separate senza interconnessione microcanali. In assenza di microcanali interconnessi, ciascuno di forma sarebbe necessario un ingresso rendendo la tecnica ingombrante. Anche se non abbiamo notato alcuna non uniformità in patterning proteine, la distribuzione delle cellule modellato all&#39;interno del microcanale può essere non uniforme. Questa disuniformità può essere dovuto alla distribuzione casuale delle cellule in cellule sospensioni, la geometria e le dimensioni dei microcanali, e la viscosità della sospensione cellulare. In futuro, questa tecnica può essere applicata ad altri tipi di substrati e cellule. Ad esempio, i gel tridimensionali come la matrice di membrana basale o impalcature di collagene possono potenzialmente essere modellati e formati utilizzando PDMS canali microfluidica. Iniettando un idrogel nel dispositivo microfluidica, l&#39;idrogel può assumere la forma del dispositivo microfluidico ed essere in grado di formare complessi schemi senza l&#39;uso di stampanti 3-D o altre tecnologie. Ciò consentirebbe per la creazione rapida di ponteggi strutturati con strumenti facilmente disponibili e dispositivi microfluidici.

In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l&#39;organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant&#39;anni 1, 2, 3. Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l&#39;interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori 4, 5, 6, 7, 8, 9. Gli attuali metodi di proteine ​​patterning includono photopatterning e stampa microcontact. Photopatterning utilizza materiale sensibile alla luce, che viene reticolato in seguito all&#39;esposizione ad ultruna viola (UV). Luce UV diretta a un fotomaschera (costituito da aree trasparenti con le regioni più scure per prevenire la trasmissione della luce UV) provoca la reticolazione in regioni specifiche che possono poi essere utilizzati per successivo fissaggio dei biomateriali o celle 10, 11. Mentre questo schema è molto preciso e consente un controllo preciso della topografia della superficie cultura, è limitato a biomolecole sensibili ai raggi UV che possono essere modellati da radiazione UV 12. Stampa microcontact è un altro metodo popolare di patterning proteine specifiche 13, 14. In questo metodo, un silossano (PDMS) timbro poli-dimetil viene trattata con una varietà di reagenti modifica della superficie prima di essere stati immersi in una soluzione del substrato biomolecolare prescelto. E &#39;poi delicatamente pressato su un vetrino di vetro o di altra superficie così &quot;stamping&quot; biomolecole sulla superficie cultura. However, stampaggio è limitata al tipo di materiale che può essere trasferito, nonche la bagnabilità di biomolecole alla superficie del timbro PDMS 15. Patterning diretto delle cellule può essere più difficile e si basa su metodi complessi come substrati commutabili, metodi basati stencil, o patterning con specifiche molecole di adesione cellulare 16, 17. Questi metodi sono limitati nella loro capacità di cellule modello a causa della mancanza di substrati di adesione cellulare compatibili, incompatibilità del processo di lavorare con cellule sensibili biologiche e vincoli, incoerenza nel riprodurre il patterning e complessità della procedura. Ad esempio, con i substrati commutabile, substrati personalizzati devono essere progettati per ogni tipo di cellula, per passare la loro adesione a specifici tipi cellulari senza degradazione per esposizione alla luce UV e calore utilizzato nel processo 17, &lt;<html> class = sup &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20. metodi di patterning basata Stencil sono versatili nella loro capacità di cellule del modello; Tuttavia, è difficile produrre matrici PDMS a spessori adeguati per l&#39;utilizzo 16, 21. L&#39;iniezione diretta di cellule in canali microfluidica PDMS hanno alcuni vantaggi quali: 1) facilità di fabbricazione di canali microfluidica e 2) di idoneità per molte cellule e substrati diversi. Tuttavia, il problema prevalente di cattura bolla d&#39;aria durante il processo di iniezione a causa della idrofobicità del PDMS senza l&#39;uso di pulizia al plasma, o altri metodi per ridurre bolle d&#39;aria, rende difficile creare costantemente cellule modellata su superfici di vetro o di plastica 21. Questo lavoro si espande su capillare micromolding 22, 23,lass = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26 e riporta un metodo per iniettare proteine e cellule sospensioni in microcanali. Il metodo utilizzato qui dimostra la patterning dei substrati ed entrambi patterning diretto e indiretto di specifici tipi cellulari. Questa tecnica supera l&#39;elevata idrofobicità di PDMS ed elimina la presenza di bolle durante l&#39;iniezione del substrato o da cellule sfruttando la permeabilità ai gas di PDMS 27. Questo documento dimostra l&#39;uso della tecnica con diversi substrati diversi e tipi di cellule. L&#39;articolo evidenzia anche la fabbricazione di stampi per la litografia morbido utilizzando la fotolitografia convenzionale nonché una semplice ed adesivo a basso costo metodo nastro utile risorse limitate impostazioni 28, 29.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device</td></tr><tr><td>Laser Printer HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Used to degass the PDMS mixture</td></tr><tr><td>Adhesive Scotch Tape</td><td>3M Product, MN</td><td>Tape 600</td><td>Used to fabricate adhesive tape Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Casting polymer</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Used to keep the mold to cast with PDMS</td></tr><tr><td>Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>Used to cut the PDMS</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Used to handle the PDMS cast during peeling</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Rubber Roller</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Germany</td><td>DWL66fs</td><td>Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Used to expose the photoresist to UV light</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Used to spin coat the photoresist on silicon wafer</td></tr><tr><td>Photoresists SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Negative photoresist used for mold fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Coat mold to avoid PDMS adhesion</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Cleaning Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Sterilization Solvent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminin aliquoted into 10 &amp;micro;L aliquots and diluted to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;L in PBS prior to use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Used to demonstrate C2C12 patterning</td></tr><tr><td>PC12 Cell Line</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Used to demonstrate PC12 patterning</td></tr><tr><td>Collagen type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Horse Serum, heat inactivated</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>To label cells</td></tr><tr><td>Calcein-AM live dead cell Assay kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Cell viability Assay</td></tr><tr><td>Biopsy Hole Punch</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Punched hole in PDMS</td></tr></tbody></table>

a versatile method of patterning proteins and cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Questo metodo consente di patterning di proteine ​​e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1) 28, 29. Abbiamo precedentemente dimostrato l&#39;uso di questo procedimento in patterning indiretta di cellule neuronali per la valutazione di guida degli assoni in fotorecettori 4, 30, e ora abbiamo dimostrato il suo impiego in diversi tipi cellulari aggiuntivi di varia origine. Embrionali di topo neuroni corticali modellate sulla poli-D-lisina (PDL) e le superfici laminina dimostrano adherenc generalee per le zone a motivi geometrici e la crescita lungo il Pdl e strisce laminina (Figura 3a). Linee cellulari di mioblasti C2C12 aderiscono anche alla zona di fantasia e dimostrano la fusione in miotubi multinucleati (figura 3b). Abbiamo anche adattato questa tecnica per patterning cella diretta come visto con fibroblasti in Figura 4. Come riportato in precedenza, questo metodo patterning cella diretta ha mostrato alcun effetto negativo sulla sopravvivenza delle cellule 30. Le variabili che portano a patterning diretto o indiretto successo di tipi cellulari indicati sono elencati nella Tabella 1 e 2. Così, in futuro, i ricercatori possono utilizzare questa tecnica per cellule di pattern e scoprire fenomeni legati alla loro patterning specifica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig1.jpg" /> Figura 1: Realizzazione di stampi da Soft litografia. A sinistra: Fotolitografiaprocesso a. SU-8 è centrifuga rivestito su un wafer di silicio, esposto a radiazioni UV, e sviluppato per eliminare l&#39;eccesso SU-8. A destra: Adesivo processo di fabbricazione del nastro. Nastro adesivo è attaccato ad un vetrino pulito, tagliato con un bisturi, e il nastro in eccesso viene rimosso con attenzione. PDMS cast è poi fabbricata da ogni stampo utilizzando la litografia soffice. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig2.jpg" /> Figura 2: esempio di dispositivo PDMS per substrato Patterning. (A) PDMS getto microfluidica con l&#39;ingresso utilizzato per patterning microfluidica di substrati. Inlet stato perforato a un&#39;estremità microcanali. (B) il canale Microfluidic come si è visto al microscopio a contrasto di fase. canali microfluidica sono 15 mm di lunghezza, 20 micron di larghezza, und separati da 200 micron. La figura 2 è riprodotto con il permesso di IOP Publishing. Tutti i diritti riservati 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig3.jpg" /> Figura 3: indiretta cellulare Patterning. (A) processo di patterning di proteine vuoto assistita. PDMS dispositivo a canale microfluidico è collegata a una piastra di Petri, soluzione di substrato viene caricato in ingresso, si applica il vuoto brevemente camera e rilasciato, dispositivo PDMS viene rimosso, modello viene lavato e pronto all&#39;uso. (B) embrionali neuroni di ratto corticali seminate su un vetrino con un substrato PDL e laminina fantasia. Linee (c) C2C12 cellule mioblasti coltivate su fantasia Pdl e laminina. Figure 3a e 3c sono riprodotti con permission da IOP Publishing. Tutti i diritti riservati 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig4.jpg" /> Figura 4: Cell Patterning diretto. (A - c) I fibroblasti fantasia via patterning cellulare diretta. (A) dispositivo a canale Microfluidic fabbricato utilizzando la litografia adesivo del nastro. (B) canali microfluidica dopo il riempimento con sospensione cellulare di fibroblasti usando il vuoto assistito tecnica patterning. (C) fibroblasti dopo la rimozione del dispositivo a microfluidi. (D) calceina-AM colorazione dei fibroblasti dopo patterning microfluidica. immagine contrasto (e) Fase di fibroblasti dopo patterning microfluidica. (F - g </strong&gt;) I fibroblasti colorati con falloidina-TRITC (rosso) e DAPI (blu). Figura 4 è riprodotto con il permesso di IOP Publishing. Tutti i diritti riservati 30. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55513/55513fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Indiretta Patterning cellulare </td><td> Substrato </td><td> Proteine Condizioni di incubazione </td><td> Densità cellulare </td><td> Adesione Cellulare Durata </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> Collagene-1 </td><td> 1 ora a 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / ml </td><td> 1 h a 37 ° C </td></tr><tr><td> fibroblasti </td><td> Collagene-1 </td><td> 1 ora a 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / ml </td><td> 1 h a 37 ° C </td></tr><tr><td> C2C12 </td><td> PDL + Laminina </td><td> 1 h a 37 ° C, lavaggio PBS, overnight a 37 ° C </td><td> 2 x 10 6 / ml </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Embryonic Rat neuroni corticali </td><td> PDL + Laminina </td><td> 1 h a 37 ° C, lavaggio PBS, overnight a 37 ° C </td><td> 2 x 10 6 / ml </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Salamander neuroni della retina </td><td> Sal-1 </td><td> notte a 10 ° C </td><td> N / A </td><td> 1 ora a 10 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1: indiretti cellulare Patterning condizioni. Elenco delle condizioni di incubazione come il tipo di substrato, tempo, temperatura e densità cellulare per tipi cellulari tipici. I ricercatori dovrebbero ottimizzare le condizioni di incubazione per i propri substrati modello e tipo di cellula. Sal-1 è il substrato anticorpo utilizzato per crescere Salamander neuroni retinici. <table border=&quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Patterning cellulare diretta </td><td> Substrato </td><td> Densità cellulare </td><td> Tempo Adesione Cellulare </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> Collagene-1 </td><td> 6 x 10 6 / ml </td><td> 1 h a 37 ° C </td></tr><tr><td> fibroblasti </td><td> Collagene-1 </td><td> 6 x 10 6 / ml </td><td> 1 h a 37 ° C </td></tr><tr><td> C2C12 </td><td> PDL + Laminina </td><td> 2 x 10 6 / ml </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Embryonic Rat neuroni corticali </td><td> PDL + Laminina </td><td> 2 x 10 6 / ml </td><td> 15 min a 37 ° C </td></tr><tr><td> Salamander neuroni della retina </td><td> Sal-1 </td><td> N / A </td><td> 1 ora a 10 ° C </td></tr></tbody></table>Tabella 2: Cell patterning diretto condizioni. Elenco delle condizioni di incubazione quali temperatura, tempo, e la densità delle cellule per tipi cellulari tipici. I ricercatori dovrebbero ottimizzare le condizioni di incubazione per il proprio tipo di cellula del modello.

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A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Views.  Rutgers University. This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Video: A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Biologia

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Mappatura dell'Emergente Organizzazione Spaziale delle Cellule Mammarie utilizzando Micropatterns e Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Biologia dello sviluppo

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparazione di microambienti a matrice extracellulare tunable per valutare schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine e cellule

Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

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Preparazione di microambienti a matrice extracellulare tunable per valutare schwann Cell Phenotype Specification

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Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

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Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

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