Name: methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors at JoVE.com

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. Evaluar el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en Pellicle y la formación de biopelículas Colonia <ol><li> Preparar una solución 2x de medio de 25 MSgg biofilm inductor definido sin el cloruro de calcio y de hierro (III) hexahidrato de cloruro. Después de la esterilización del filtro, añadir el cloruro de calcio. El medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Preparar la dilución 1x MSgg en el día del experimento. <ol><li> Diluir el medio 2x MSgg a 1x con agua destilada estéril (unas películas) o (80 ° C) de 3% agar caliente estéril (biofilms) y añadir de hierro (III) hexahidrato de cloruro a una concentración final de 50 mM (unas películas) o 250 mm ( biofilms). Añadir antibióticos o inhibidores de moléculas pequeñas a la concentración deseada y se mezcla bien. Por ejemplo, para obtener una concentración final de 0,5 mM D-leucina en 30 ml de establecer unas películas o biofilms, agregar 196,6 l de un 76,3 mM (10 mg / ml) solución madre de D-leucina. NOTE:. La composición final 1x MSgg se describe en la Tabla 1 en comparación con la receta original 25, el medio contenía 50 mg / ml treonina y la concentración de hierro para crecer colonias de biopelícula en medio MSgg sólido se incrementó 2,5 veces para optimizar la morfología de las colonias arrugada . </li></ol></li><li> Después de la solidificación del agar, se secan las placas MSgg sólidos en una campana biológica de 30 a 45 min antes de la inoculación. </li><li> Para seleccionar inhibidores específicos que interfieren con los mecanismos de formación de película (Figura 1), descartan que las concentraciones utilizadas afectan planctónicas y el crecimiento estática. <ol><li> Determinar el crecimiento planctónicas (aumento de la densidad óptica con el tiempo en cultivo líquido) en una curva de crecimiento sencilla mediante la medición de la densidad óptica a 600 nm cada hora hasta que la fase de crecimiento estacionario. </li><li> Para confirmar que la turbidez del cultivo medido representa el recuento de células vivas, determinar el número de unidades formadoras de colonias (CFU)de las células en la fase de crecimiento planctónicas de un cultivo en agitación después de varios puntos de tiempo. </li><li> Para evaluar el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en el crecimiento película estática, las células de la cosecha al final de una incubación de 3 días a 23 ° C a partir de una de 24 pocillos de cultivo celular bien, se inocularon en las mismas condiciones como se describe en las secciones 1,7-1,9 y determinar la CFU. Para este control, utilizar una cepa deficiente en película que carece de los operones que codifican para los componentes de la matriz extracelular (es decir, B. subtilis Δ EpsH, Δ TASA). NOTA: Esta cepa es capaz de crecer en condiciones estáticas, pero en contraste con un tipo salvaje de formación de película-, es deficiente en la capacidad de flotar a la interfaz aire-líquido, donde el crecimiento es favorecido debido al aumento de los niveles de oxígeno 26. Por lo tanto, esta Matriz extracelular y la tensión película es deficiente en una cepa de referencia recomendado para evaluar el crecimiento en condiciones estáticas. NOTA: Para el ex específicaamplia de la D-amino ácido D-leucina no canónica describe a continuación, un efecto sobre el crecimiento del plancton y estática en concentraciones que interferían con la formación de película se descartó 12,17. Los métodos para determinar planctónicas y el crecimiento estática se describen en detalle 17. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general conceptual para la identificación de una configuración experimental sólida para evaluar la inhibición específica de la formación de biopelículas. Criterios de selección de inhibidores de moléculas pequeñas que indican interferencia específica con la formación de biopelículas sin efecto pronunciado sobre el crecimiento del plancton. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <ol start="5"><li> Consecutivas a cabo B. subtilis de una reserva de C -80 ° (LB culture de 10 9 células / ml congelados en glicerol al 20%) para aislar colonias individuales sobre una placa de agar LB-1,5% con una punta estéril o aplicador. </li><li> Crecer durante la noche a 30 ° C. </li><li> Paso crítico: Para una inhibición película sólida por los D-aminoácidos no canónica tales como D-leucina, crecer una sola colonia recogió de la placa de agar LB-1.5% en 3 ml de caldo LB a 37 ° C durante 4 horas en una sacudiendo incubadora (velocidad de agitación 200 rpm). Reemplazar el caldo LB con medio MSgg biofilm inductor antes de la inoculación mediante la centrifugación de cultivo 1,5 ml de arranque durante 4 minutos a 6.000 xg, eliminando cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1,5 ml de medio MSgg. El resto de la cultura puede ser desechada. Importante: Para garantizar la robustez del sistema, la densidad óptica a 600 nm (OD 600) del cultivo iniciador se lavó debe estar entre 0,6 y 1. </li><li> Durante el crecimiento del cultivo iniciador, preparar una placa de cultivo celular multiplaca de 12 pocillos containinG 3 ml de medio de MSgg sin o con un rango de concentración del inhibidor de molécula pequeña (por ejemplo, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Para descartar los efectos de borde, distribuir la ubicación de las diferentes concentraciones a través de la placa de multiplaca. Alternativamente, utilizar de 24 pocillos de cultivo celular placas multiplaca que contienen 1,5 ml de medio de MSgg. </li><li> Inocular los pocillos de la placa multiplaca de cultivo celular de 12 pocillos con 3 l de cultivo iniciador se lavó (dilución 1: 1000). NOTA: una relación de dilución inferior, es decir, 1: 500 puede ser utilizado. Esto disminuye el tiempo de desarrollo de las unas películas. </li><li> Cultivar las unas películas a 23 ° C bajo condiciones estáticas durante tres días. No mueva las unas películas durante este tiempo, ya que puede afectar a la morfología de la superficie final de la película. </li><li> Adquirir imágenes con una exposición binocular y homogénea de un rayo. Como alternativa, tomar una imagen de las unas películas con una cámara de alta resolución. Para evitar artefactos causados ​​por inconsisángulos y sombras luz de la tienda, toman de arriba hacia abajo imágenes con la cámara fija en un trípode y el uso de una fuente de luz suave y grande a 45 ° de ambos lados. NOTA: Un método alternativo para estudiar B. subtilis pluricelularidad es el ensayo de colonias de biopelícula en medio sólido, biofilm inductor MSgg. Al igual que unas películas, este ensayo permite el estudio de los procesos espacio-temporales. Una vez que se determina el intervalo activo de los inhibidores de molécula pequeña, su efecto sobre la formación de colonias biofilm puede ser estudiado. </li><li> Para crecer colonias de biopelícula, simétricamente detectar 1,5 l de la pre-cultivo sin lavar (Paso 1.7) en la placa de agar 1,5% MSgg seca con la ayuda de una plantilla - 4 gotas por placa Petri de diámetro de 8,5 cm. Deje que las gotas se adsorben a la placa antes de moverlos. NOTA: La plantilla de ayuda a conseguir una distribución equitativa de las colonias de biofilm dentro del área donde se cultivan las células. Para preparar la plantilla, dibujar la superficie total del crecimiento en las escalas originales, dividirlo a la igualdad de sectaORS y marque el centro. Para un plato redondo Petri de 8,5 cm de diámetro, este asigna 14 cm 2 a una colonia biofilm. </li><li> Incubar las placas a 30 ° C durante tres días. Durante este tiempo, las colonias de biopelículas se desarrollan y forman una estructura tridimensional, arrugada. </li><li> Tomar fotografías como en el paso 1.11. </li></ol> 2. El etanol Ensayo de Resistencia <ol><li> Crecer biopelículas como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Después de 68 h de crecimiento a 30 ° C, cortar las colonias de biopelículas en dos partes iguales con la ayuda de una cuchilla de afeitar y la plantilla. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Ejemplo de diseño experimental para evaluar la resistencia de las células de colonias de biopelículas de agentes esterilizantes. Plantilla (A) utilizada para la distribución equitativa de las colonias de biopelícula a través de una placa de Petri y para el corte. (B)las imágenes de arriba hacia abajo sin tratar de biopelícula de tipo salvaje cultivadas durante 68 horas en un medio sólido, definido biopelícula que inducen MSgg a 30 ° C. La ampliación muestra cómo una colonia de biopelículas se puede cortar en dos mitades iguales. (C) Las dos mitades iguales biopelículas son tratados por igual (control, PBS) o con PBS o agente esterilizante y se procesa como se ha descrito. Barra de escala:. 1 cm <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Levante con cuidado cada mitad de la colonia de la biopelícula de la placa de agar con una pequeña espátula y moverlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Si es necesario, raspar las células restantes de la placa y transferirlos al tubo de microcentrífuga también. NOTA: El segundo medio de la colonia biofilm se trata diferencialmente, dependiendo de si es el control o para probar la resistencia a la Steriagentes Lizing. </li><li> Para el control, se incuba la segunda mitad de la colonia de biopelículas en 500 l de PBS como en el paso 2.3. Para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes, transferir la segunda mitad de la colonia biopelícula a 500 l 50% (v / v) de etanol. NOTA: Alternative esterilización agentes tales como el hipoclorito de sodio se puede utilizar. Para todos los agentes de esterilización utilizados, determinar la concentración y tiempo de incubación activo en un experimento preliminar. </li><li> Incubar las colonias de biofilm por 10 min en el banco-tapa a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las colonias biofilm durante 5 minutos a 18.000 xg y retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Añadir 300 l de PBS. </li><li> Sonicar las células ligeramente (amplitud 10%, pulso 5 seg), con la micropunta de un aparato de ultrasonidos. NOTA: La energía de ultrasonidos debe ser suficiente para los agregados de biopelícula separadas. Sin embargo, demasiado duro sonicación puede lisar las células. Confirmar con antelación por microscopía de luz que la energía de ultrasonidosutilizadas no lisar las células y que todos los agregados se disuelven. </li><li> Añadir 700 l de PBS a un volumen final de 1 ml. Realizar una dilución en serie (a 10 -7) en PBS y se extendió 100 l de 3 diluciones en una placa de agar LB 1.5%-usando perlas de vidrio estériles. NOTA: Las diluciones óptimas para ser plateado debe determinarse en un experimento preliminar, ya que esto depende de la cantidad de células en la colonia biofilm de interés y la tasa de supervivencia de las células en respuesta al agente de esterilización. </li><li> Incubar las placas durante la noche a 30 ° C, contar el CFU y determinar CFU / ml. Desde el final de UFC / ml de cada una de las colonias de la mitad de la biopelícula, se calcula el porcentaje de supervivientes. NOTA: Cuando se realiza y se analizaron como se ha descrito, las dos mitades de la colonia de control de la biopelícula y el no tratado frente a un medio de etanol-tratada de la colonia de la biopelícula no tratada debe producir diferencias a continuación 10% en los recuentos de células viables, la verificación de la simetría o la resistencia de la colonia , respectively. Alternativamente, los resultados pueden ser representados en total CFU. Los recuentos de células de control y colonia biofilm sin tratar deben permanecer en el mismo orden de magnitud. Por el contrario, se espera que los recuentos de células de la mitad tratados con etanol de una pequeña colonia de biopelículas molécula tratados de pasar por un mínimo de dos órdenes de magnitud a reclamar por un aumento de la sensibilidad al agente esterilizante. </li></ol> 3. El biofilm colonia Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido <ol><li> Crecer colonias de biopelícula como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Preparar un nuevo lote de 2% (v / v) de glutaraldehido, 3% (v / v) de solución de paraformaldehído en cacodilato de sodio 100 mM, 5 mM de tampón de cloruro de calcio, pH 7,3. Preparar 5 ml de fijador para cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro. PRECAUCIÓN: glutaraldehído y paraformaldehído son peligrosos. Manejarlos con el equipo de seguridad dentro de una campana química. Descartar las soluciones y los materiales contaminados a la ZACresiduos peligrosos. </li><li> añadir con cuidado el fijador a las colonias de biopelícula, sin dispensar directamente en la parte superior de las biopelículas. NOTA: Debido al carácter hidrófobo de la colonia biofilm, las colonias se desprenden lentamente del agar y comienzan a flotar. </li><li> sellar cuidadosamente las placas con una tira de Parafilm. Incubar en un agitador rotatorio durante 2 horas a temperatura ambiente y, posteriormente, transferir las placas a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, retire con cuidado el líquido con una pipeta Pasteur de vidrio conectado a una bomba de vacío. </li><li> Añadir cuidadosamente 10 ml 100 mM de cacodilato de sodio, tampón de cloruro de calcio 5 mM para lavar el biofilm y se incuba durante 5 min. Retire con cuidado el líquido con la pipeta Pasteur de vidrio desde la esquina de la placa para evitar dañar la biopelícula y añadir solución de lavado fresca por pipeteo suave. Repita este paso una vez. </li><li> Para la deshidratación de las colonias de biopelícula, continúe con los siguientes pasos: 2x 5 min en ddH2O; 2x 20 min en 30% de etanol; 2x 20 min en 50% de etanol; 2x 20 min en 70% de etanol; 2x 20 min en 96% de etanol; 2x 30 min en 100% de etanol. <ol><li> Añadir 15 ml de líquido por cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro en cada paso y eliminar el líquido cuidadosamente después de cada incubación. </li></ol></li><li> Utilizar uno de dos métodos diferentes para el secado de las muestras en etanol. <ol><li> Para el secado al aire a partir de etanol: <ol><li> Cortar un papel de filtro de celulosa (diámetro de 9 cm) en cuartos. Brevemente sumergir una cuarta parte en etanol al 100%, y luego transferir cuidadosamente una colonia flotante de biopelículas en la misma. Ponga el papel de filtro húmedo en una placa de Petri forrada con un papel de filtro. Cubrir la placa de Petri y dejar que las colonias biofilm secar durante la noche en una campana química. </li></ol></li><li> Por punto crítico (CP) SECADO utilizando dióxido de carbono (CO 2) como fluido de transición: <ol><li> Llenar 75% de la cámara de la máquina punto de secado crítico con 100% de etanol. La transferencia de las muestras en un soporte, cada muestra en su propia cHamber. Si es necesario, cortar el biofilm con tijeras en trozos más pequeños. Deje las muestras sumergidas en etanol durante toda la manipulación. A continuación, transferir el soporte en la cámara y cerrar la cámara herméticamente. </li><li> Se enfría la cámara a 7 ° C y empezar a agitar. Llenar la cámara completamente con CO2 líquido. Durante un tiempo de incubación de 7 minutos, dejar que la mezcla de etanol con el CO 2. A continuación, la descarga 25% de la solución. NOTA: No vaciar la cámara por debajo del nivel de la muestra. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cuatro veces. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cinco veces con un tiempo de incubación de tan sólo 5 min. Finalmente, el etanol debe ser completamente sustituido por CO 2. </li><li> Durante la última ronda, vacío sólo el 5% de la cámara. Apagar la agitación y el enfriamiento. Iniciar el calentamiento de la cámara a 42 ° C. A una temperatura de 31,1 ° C y una presión de 73,9 bar, el CO2 líquido alcanza su punto crítico, el estado en el que el pH gaseosaASE tiene la misma densidad que la fase líquida del disolvente 27. Una vez que la temperatura alcanza 42 ° C, se incuba durante 10 min. A 42 ° C, las emisiones de CO 2 en la cámara existe como gas supercrítico. NOTA: comprobar constantemente la presión de la cámara. La presión no debe superar los 120 bar a 42 ° C. </li><li> Comience lentamente para liberar el gas con calentamiento continuo. Esto mantiene las muestras en la fase de CO 2 -gas y previene la deformación de la morfología de la muestra a través de la tensión superficial del líquido. Ajuste el medidor de flujo a 5 L / hr por el ajuste fino de la válvula dosificadora controlar el medidor de caudal. Espere hasta que se suelta el que toda la presión en la cámara. Ahora abre la cámara y retirar las muestras cuidadosamente del soporte. </li></ol></li></ol></li><li> Escudo una microscopía electrónica de talón con cinta de carbono. Con la ayuda de pinzas, transferir cuidadosamente las colonias biofilm sobre el trozo. Conectar cada colonia para el talón mediante la adición de un delgado puente de cocheBon cinta, que es crucial para la eliminación de carga bajo el haz de electrones. En esta etapa, manejar las colonias de biopelícula con cuidado, ya que son muy frágiles. Almacenar las muestras en un desecador durante al menos 24 horas o hasta que el examen. </li><li> El día del examen con el microscopio electrónico de barrido, por pulverización catódica-capa de las colonias de biopelícula para 2 min en un ángulo de 60 ° en un oro-paladio por bombardeo iónico revestidor. Repita este paso dos veces y girar las muestras en 120 ° en el medio. Al final, por pulverización catódica abrigo de las muestras una vez durante 3 minutos desde la parte superior. La capa delgada 20 nm de oro-paladio mejora la conductividad y mejora el contraste de la muestra para la formación de imágenes en el SEM. </li><li> Almacenar las muestras en un desecador para evitar la rehidratación de la muestra 28 hasta la formación de imágenes con un microscopio electrónico de barrido 29,30. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bacillus subtilis formas robustas y altamente estructurados biopelículas tanto en estado líquido (unas películas) y en medio sólido (colonias). Por lo tanto, sirve como un organismo modelo ideal para caracterizar el modo de acción de los inhibidores de biopelículas específicas. En medio sólido, las células forman estructuras multicelulares con rasgos distintivos que no son evidentes en unas películas, como las arrugas que irradian desde el centro hasta el borde. Por lo tanto, unas películas y las colonias son sistemas complementarios para estudiar B. pluricelularidad subtilis. El objetivo de este estudio es desarrollar un B. subtilis sistema modelo para el biofilm (unas películas y colonias) inhibición. Varios pasos son críticos para la reproducibilidad del ensayo biofilm perturbación. Un primer paso crítico es confirmar que el efecto sobre la formación de biopelículas no se debe a una toxicidad general para bacterias que crecen en el estilo de vida planctónica. Esto puede ser considerado por comparación del efecto de una concentración dada de comocentro comercial inhibidor de molécula en la inhibición de biopelículas en relación con el efecto de esta molécula en el crecimiento planctónicas. Un efecto más fuerte de manera espectacular en el desarrollo de la biopelícula puede garantizar la identificación de mecanismos de destino que son específicamente importante para el desarrollo de biopelículas. Además, el estudio descrito en este documento demuestra la importancia de las condiciones de pre-cultivo para el desarrollo de unas películas y su sensibilidad a moléculas pequeñas. Antes de la caracterización de los efectos de moléculas pequeñas, reproducibles y robustos condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura de crecimiento película y la falta de sensibilidad a la composición de los medios de comunicación) para probar sus efectos debe ser definido. Para encontrar tales condiciones, los medios de comunicación de la condición pre-cultivo, la fase de crecimiento de los medios de pre-cultivo, los medios de eliminación de pre-cultivo, el crecimiento y la temperatura de crecimiento deben ser considerados. Un reto importante, una vez que se encuentra un inhibidor específico de la formación de biopelículas, es encontrar cuantitativay los métodos cualitativos que caracterizan los efectos de estos inhibidores de molécula pequeña sobre el desarrollo de biopelículas y la resistencia. Aquí, dos metodologías importantes se describen en detalle que se puede utilizar para evaluar los efectos de tales inhibidores. En primer lugar, introducimos un método cuantitativo simple que puede sondear de forma reproducible la resistencia de tratados frente a biofilms de colonias no tratadas a bactericidas, tales como el etanol. Los resultados representativos se muestran para la sensibilidad de las colonias de biofilm D-leucina-tratada a 50% de etanol. Sin embargo, este ensayo se puede modificar fácilmente mediante el uso de agentes esterilizantes diferentes o antibióticos. En segundo lugar, un método de SEM se describe en detalle que permite alta resolución examen de los cambios en la colonia biofilm causado por el inhibidor de molécula pequeña en varios niveles complementarios: la estructura general, la organización y la abundancia de la matriz de EPS y sus componentes, y la morfologías unicelulares a lo largo de la biopelícula. Observamos que los dos métodos de dehydratien (secado al aire de 100% de etanol o CP-secado utilizando dióxido de carbono como fluido de transición) se puede utilizar igualmente durante la preparación de la muestra SEM de una colonia de la biopelícula. Es importante destacar que la fijación con éxito de la muestra biofilm se basa en gran medida de la hidrofobicidad de la colonia biofilm. Esta hidrofobicidad es una característica intrínseca de B. biofilms subtilis, debido a la capa superficial hidrófoba 10,34. Varios métodos se han aplicado previamente para estudiar conjunto de biofilm y desarrollo con B. subtilis como un organismo modelo 35. Un número de estudios independientes demostrado los efectos de la composición del medio en el desarrollo de biopelículas 36-38. Hasta ahora, sin embargo, una evaluación sistemática de los efectos de la composición del medio de la inhibición de biopelículas fue, a lo mejor de nuestro conocimiento, que carece. Este estudio demuestra que mientras que la inhibición de película B. subtilis por moléculas pequeñas es sensible a las condiciones pre-cultivo, es Unaffected por los efectos de la temperatura y la composición del medio, y por lo tanto útil para pantallas sistemáticas de los inhibidores de moléculas pequeñas. Además, se estableció un método sencillo, reproducible y cuantitativo para evaluar la resistencia de la molécula sin tratar o pequeño tratados con inhibidor de colonias de biopelícula a agentes antibacterianos, que actualmente carecen en el modelo de biopelícula organismo B. subtilis. B. subtilis biopelículas en combinación con los reporteros fluorescentes se pueden tomar más que buscar inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen tanto en un acto específico del desarrollo de la formación de biopelículas o una subpoblación específica de células dentro de la biopelícula. Los métodos descritos aquí no proporcionan resolución de una sola célula en términos de la expresión de genes dentro de la biopelícula. Los métodos para el análisis de expresión génica matriz dentro de EPS B. biopelículas subtilis a nivel de células individuales se establecieron con éxito 39. biopelículas bacterianas son de Crucial importancia en los entornos agrícolas, industriales y clínicos. En un contexto agrícola, la capacidad para formar biopelículas aumenta la colonización vegetal huésped de numerosos patógenos de plantas 40, y en un contexto clínico, los biofilms son inherentemente resistentes a los agentes antimicrobianos y 21 están en el centro de muchas infecciones bacterianas persistentes y crónicas. Además, ahora se reconoce que las biopelículas tienen enormes repercusiones en los costos para la industria ya que son extremadamente difíciles de eliminar y controlar 41. Por lo tanto, el desarrollo de un marco experimental para el estudio de los inhibidores de biopelículas microbianas proporcionará significativas agrícola 42,43, 21,44 clínicos, y tecnológicos 45-47 avances. Los métodos actuales se limitan a B. subtilis. Alentamos siguiendo los conceptos cuantitativos y cualitativos descritos para estudiar los inhibidores de moléculas pequeñas-biofilm específico en otras especies también. en adición<html> , Este estudio se refiere a un ejemplo específico para la inhibición de biopelículas por D-leucina, de varios inhibidores de biopelículas específica publicó anteriormente 17. Es importante destacar que, D-leucina ya se caracterizó por ser una molécula anti-biopelícula en el fitopatógeno Xanthomonas citri 48, presentando posibles similitudes entre la colonización vegetal y la formación de biopelículas. La formación de biopelículas (película y la formación de colonias rugosas) es también común en los patógenos humanos (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia 49-51 uropatógeno coli 52,53). Los métodos descritos pueden desarrollarse más para buscar fármacos específicos que inhiben la formación de biopelículas y reducir la resistencia mediada por la biopelícula a los agentes antimicrobianos en la investigación clínica. En general, los métodos descritos aquí se pueden utilizar como una base para desarrollar conceptos cuantitativos y cualitativos para estudiar los inhibidores de molécula pequeña-biofilm específica en otras especies. nt &quot;&gt; En resumen, nos proporcionan una sencilla y útil herramienta para usar que demuestra las ventajas potenciales y los riesgos en el uso de B. subtilis para estudiar los inhibidores de biopelículas.

comunidades bacterianas multicelulares juegan un papel importante en entornos naturales y antropogénicos, y pueden ser beneficiosos o perjudiciales altamente. Estas colonias multicelulares se conocen como las biopelículas, en donde las células individuales están incrustadas en un (EPS) matriz de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia. Los EPS se adhieren fuertemente a las células a la superficie que colonizan. Ellos sirven como un escudo contra las fuerzas mecánicas y químicas y crean un estrecho contacto entre las células vecinas, lo que facilita la comunicación celular 1. Una biopelícula puede ser vista como una comunidad diferenciada, donde las células uso altamente regulados, procesos orquestada para coordinar sus actividades dentro de la comunidad, así como en todas las especies 2-5. La transición de un planctónicas, el modo de vida libre de crecimiento a un estado de biopelícula se asocia a menudo con los procesos de desarrollo. Un buen ejemplo es la bacteria del suelo Bacillus subtilis Gram-positivas, y por lo tanto, una undomecepa sticated sirve como un modelo sólido organismo para estudiar las etapas de desarrollo que conducen a la formación de biopelículas. En esta bacteria, células móviles se organizan en estructuras multicelulares visibles que llevan a cabo tareas especializadas 4. Un grupo de células, la matriz-productores secretan exopolisacáridos 6, la proteína amiloide TASA 7,8, y la proteína de hidrofobicidad de la superficie BSLA 9,10; todos los cuales participan en el montaje de las EPS 11-13. Dada la abundancia de biopelículas en nichos naturales y antropogénicos y el daño fatal putativa que pueden causar, hay una necesidad urgente de encontrar formas de prevenir su formación. inhibidores de moléculas pequeñas pueden ayudar en el descubrimiento de nuevas rutas reguladoras, enzimas y proteínas estructurales que participan en la formación de biopelículas, y por lo tanto promover puntos de vista en los complejos procesos de montaje comunidad multicelular. Como B. subtilis es un modelo bien estudiado para bioformación de película 14,15, que puede ser utilizado para evaluar los efectos de varios inhibidores de biopelículas. Este estudio fuerza a cuatro métodos fundamentales que son clave para evaluar la respuesta de las biopelículas a los inhibidores de moléculas pequeñas. En primer lugar, para asegurar que estos inhibidores tienen un objetivo del biofilm específica, la separación del efecto sobre el crecimiento planctónicas del efecto sobre la formación de biopelículas es crítica. La mayoría de los agentes antibacterianos dirigen a las células en su fase de crecimiento del plancton, pero las moléculas que se dirigen a la forma de vida de biopelículas son raros. Adicionalmente, como moléculas que no afectan el crecimiento planctónica no son tóxicos, pueden reducir la presión selectiva que favorece mutantes resistentes a los antibióticos 16. Por ejemplo, cuando biofilms se tratan con D-aminoácidos o ciertas otras moléculas pared interferir celular, o bien son perturbados o desmontados, pero estos inhibidores sólo afectan ligeramente 12,17 crecimiento planctónicas. Por el contrario, muchos antibióticos alteran dramáticamente el crecimiento del plancton, con little o ningún efecto sobre la formación de biopelículas 17. En segundo lugar, se establece un marco experimental consistente y robusta para estudiar el efecto de las moléculas pequeñas es crucial. Hemos observado que el intervalo de concentración activa de inhibidores de moléculas pequeñas era sensible a las condiciones de pre-cultivo y para la configuración experimental utilizada para estudiar el efecto de estos inhibidores de molécula pequeña. Varios informes, en particular los que estudian B. subtilis, reveló variaciones en el rango de concentración en la que D-aminoácidos inhiben la formación de unas películas - las biopelículas bacterianas flotantes 12,17-19. Los resultados presentados aquí sugieren que los siguientes factores explican las diferencias en el rango de concentración activa: las condiciones de pre-cultivo (12,17 logarítmica frente fase de crecimiento del 20-estacionaria tardía), el medio de cultivo utilizado en la condición de pre-cultivo (rico, indefinido [caldo Luria, LB] frente define [glutamato monosódicoglicerol, MSgg]), la relación de la inoculación y, especialmente, la eliminación del medio de pre-cultivo antes de la inoculación. La temperatura de crecimiento de película estática mostró un papel menos importante en la gama de actividad de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina, un ácido D-amino representativo utilizado en este estudio. Por último, una vez que las biopelículas son tratados con inhibidores específicos de biopelícula, se requieren métodos robustos e informativas para caracterizar los efectos de estos inhibidores sobre la aptitud de biopelículas. Aquí, se describen dos métodos para caracterizar de forma independiente el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en detalle: (1) El efecto sobre las células individuales dentro de una colonia biofilm y su resistencia a los agentes antimicrobianos. Las células en las biopelículas son típicamente más resistentes a los antibióticos en comparación con bacterias de vida libre 21-23. Aunque este fenómeno es multifactorial, la capacidad de los EPS para reducir la penetración de antibióticos se considera a menudo como una explicación atractiva 24 </sup&gt;. Este método evalúa la supervivencia de las células del biofilm preestablecidos después de la exposición a las sustancias antibacterianas. (2) El efecto sobre la arquitectura colonia biofilm, de la gran a la pequeña escala. colonias Biofilm se caracterizan por su estructura tridimensional y la presencia de los EPS. Utilizando microscopía electrónica de barrido, los cambios en la morfología celular, estructura colonia biofilm y la arquitectura y la abundancia de los EPS se pueden visualizar desde la grande (mm) a la pequeña escala (micras).

<table><tbody><tr><td>Luria Broth, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 136.09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino)propanesulfonic acid</td><td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>magnesium chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Merck, 203.30 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride anhydrous</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>iron(III) chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 270.30 g/mo)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>zinc chloride anhydrous&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>thiamine hydrochloride</td><td>Sigma, 337.27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Sigma, 165.19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma, 119.12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glycerol anhydrous</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid monosodium salts hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucine</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>ethanol anhydrous</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>circular cellulose filter papers</td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMS, 16% in water</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Merck, 214.05 g/mol&amp;nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride 2-hydrate</td><td>Merck, 147.02 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1172113</td><td></td></tr><tr><td>stub-aluminium mount</td><td>EMS, sloted head</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>carbon adhesive tape</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &amp;deg;C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 30 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 23 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, 500 ml, polystyrene</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&amp;nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Critical Point Dryer</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

El ensayo de película es un método para estudiar los procesos altamente regulados y dinámicas de B. pluricelularidad subtilis. Además de esto, el ensayo de película es adecuado para ensayar una serie de cualquiera de las condiciones pre-arranque o pequeñas concentraciones de moléculas en una placa única multiplaca de cultivo celular en un experimento. Sin embargo, B. formación de película subtilis es sensible a las condiciones de pre-cultivo (por ejemplo, medio de crecimiento de la pre-cultivo y su fase de crecimiento), la relación de la inoculación y la eliminación del medio de pre-cultivo. por lo tanto, que exhibió por primera vez para un montaje experimental que nos ha permitido reproducir la inhibición película de D-leucina. Nuestros resultados muestran que la inhibición de película reproducible por D-leucina se puede obtener si las células son pre-cultivaron en medio definido, rico LB a una fase de crecimiento semilogarítmica (sola colonia en 3 ml de LB a 37 ° C durante 4 horas con agitación ), se centrifugaron y se resuspendieron en medio MSgg definido antes de un 1: 1000 inoculadosion (Figura 3A). Cuando las células se cultivaron en medio MSgg a la semilogarítmica fase de crecimiento (una sola colonia en 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluido 1: 100 a 3 ml MSgg, y se cultivaron durante 5 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm), la eliminación del medio de pre-cultivo no tenía un efecto sobre la actividad D-leucina. Las células cultivadas a la fase de crecimiento estacionario (sola colonia en 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluidos 1: 100 a 3 ml MSgg, y cultivadas durante un máximo de 20 horas en un rodillo a temperatura ambiente) y se lavaron en medio MSgg antes de la inoculación fueron menos sensibles. Sin embargo, este aumento de la resistencia hacia el efecto de inhibición de película de D-leucina podría ser debido a la mayor densidad de células de la pre-cultivo, el aumento de la relación de la inoculación. La relación de inoculación de la pre-cultivo para el crecimiento en un medio estático MSgg, es decir, 1: 500 o 1: 1000, influyó en el rango de actividad de D-leucina y el tiempo de desarrollo de película (Figura 3B). la inhibición película de D-leucina se produjoa diferentes temperaturas de crecimiento (23 ° C y 30 ° C, Figura 3C). Es importante destacar que, mientras que la sensibilidad de las células a D-leucina depende de las condiciones de pre-cultivo, la reproducibilidad de los fenómenos a diferentes temperaturas demuestra que la inhibición de película por la pequeña molécula de D-leucina tiene características robustas. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig3.jpg" /> . Figura 3. Ejemplo resultados que muestran los efectos de varias condiciones pre-cultivo sobre la inhibición película de D-leucina Varios parámetros tienen que ser evaluados para obtener una configuración experimental robusta, incluyendo: extracción (A) de los contaminantes del crecimiento anterior a la cultura medio (no lavado frente a lavado), medio de crecimiento de la pre-cultivo (, medio LB indefinido o definido rica biofilm inductor medio MSgg), y el estado de crecimiento de la pre-cultivo (logarítmica frente fase de crecimiento estacionario), (B) Relación de inoculación (1: 1000 frente a 1: 500) de la pre-cultivo en el medio de crecimiento película final, y (C de temperatura) el crecimiento (23 ° C frente a 30 ° C) B.. células subtilis NCIB 3610 se cultivaron en el medio indicado (LB o MSgg) durante 4 horas a 37 ° C o a temperatura ambiente durante la noche (o / n) con agitación, y medio de pre-cultivo se reemplazó por MSgg si está indicado (lavados o no lavado). Por último, el cultivo iniciador se inoculó 1: 1.000 si no se indica lo contrario, y unas películas fueron cultivadas bajo condiciones estáticas a 23 ° C durante tres días. fotografías de arriba hacia abajo fueron adquiridas con una cámara. Así diámetro es de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de la identificación de las condiciones pre-cultivo y un montaje experimental que permitió un intervalo de actividad reproducible de Dleucina en la formación de película (precultivo crecido en LB a una fase de crecimiento semilogarítmica, se lavaron en MSgg, se diluyó 1: 1000 y se cultivaron a 23 ° C durante tres días), el efecto fue probado por su robustez. Para ello, la actividad de D-leucina en la formación de película se evaluó en varios medios MSgg modificado (Figura 4). El intervalo de actividad de D-leucina en la inhibición película fue consistente en los cinco medios ensayados, y muestra que el efecto de la D-leucina en la formación de película es robusto. Una tendencia similar se observó con D-tirosina, donde la inhibición de película en el rango de concentración de hasta 2 M fue consistente en varios medios de comunicación MSgg modificado (menor concentración de hierro y la sustitución de la fuente de nitrógeno con cloruro de amonio o la fuente de carbono con glucosa, los datos no mostrado). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig4.jpg" /> Figura 4. Sensibilidad a la D-leucina se produce endiversos medios de crecimiento. Se muestran fotografías de arriba hacia abajo de B. subtilis NCIB 3610 unas películas, que se cultiva en condiciones estáticas a 23 ° C en medio definido, biofilm inductor de MSgg o en diferentes medios MSgg modificado (fuente de carbono glucosa al 0,5%; fuente de nitrógeno 0,5% (NH 4) 2 SO 4; alto contenido de hierro de 250 M FeCl 3; bajo glicerol 0,125% de glicerol) durante tres días, excepto para el medio de fuente de nitrógeno alternativa (donde se cultivaron las unas películas durante cinco días), ya sea sin o con D-leucina a las concentraciones indicadas. cultivos iniciadores se cultivaron durante 4 horas a 37 ° C con agitación en un medio definido, rico LB. Antes de la inoculación, las células se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en el medio de crecimiento película correspondiente. El cultivo iniciador se diluyó 1: 1.000, el diámetro del pozo es de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; Un método alternativo para el estudio de B. subtilis pluricelularidad es el ensayo de colonias de biopelícula en medio MSgg sólido. Al igual que unas películas, este ensayo permite el estudio de los procesos espacio-temporales. Una vez que el rango activo de los inhibidores de moléculas pequeñas se determina en el sistema de película, su efecto sobre la formación de colonias biofilm puede ser estudiado. En este estudio, se utilizaron colonias biofilm para evaluar el efecto de la D-leucina en la resistencia de las colonias de biopelícula a agentes esterilizantes, porque colonias biofilm son menos frágiles y en el fondo sólido, son más fáciles de manipular. Cuando las colonias biofilm tratados con D-leucina están expuestos a 50% de etanol durante 10 min, el porcentaje de células supervivientes gotas drásticamente en comparación a la fracción no tratado (Figura 5). Este método puede seguir desarrollándose para evaluar los efectos de otros inhibidores de moléculas pequeñas y sus efectos sobre la resistencia a los agentes bactericidas (sterilagentes izing o antibióticos). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplo de resultados de resistencia colonia biofilm no tratada o tratada contra un agente de esterilización. Biofilm colonias de B. subtilis NCIB 3610 se cultivaron en medio sólido, que se define por 68 horas a 30 ° C, con o sin 0,5 mM D-leucina. Después de cortar las colonias en dos mitades iguales, una mitad se trató con PBS (control interno) y el otro medio con 50% de etanol o PBS (control). Después de sonicación suave, dilución en serie, placas y el recuento de las unidades formadoras de colonias, se calculó el porcentaje de supervivientes en comparación con el control interno. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes con los promedios de dos (A) o tres (B, C) se replica y sus desviaciones estándar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí t</a>o ver una versión más grande de esta figura. Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para centrarse en la arquitectura espacial de las arrugas de colonias biofilm, la abundancia y localización de la EPS y la morfología de células individuales 31. imágenes SEM requiere muestras que se pueden obtener imágenes con alto vacío. Para investigar muestras bajo condiciones de alto vacío, todas las moléculas de agua a granel que se han eliminado, y por lo tanto, las imágenes SEM requiere la deshidratación de la muestra antes de la imagen. Alternativamente, las muestras se pueden obtener imágenes en condiciones de bajo vacío en el modo de mojado por microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM), donde la muestra hidratada se seca suavemente en la cámara del microscopio. Para evaluar los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas de arquitectura colonia biopelícula, la organización celular y la morfología EPS, se compararon tres tipos diferentes de deshidratación de la muestra: secado en el microscopio bajo mo húmedade condiciones (ESEM), se secó al aire a partir de un punto de disolvente o crítica (CP) -dried utilizando dióxido de carbono como fluido de transición. En sin tratar y tratada D-leucina-B. se pudieron observar subtilis colonias biofilm diferentes etapas de hidratación de acuerdo con el método utilizado. Formación de imágenes en condiciones de bajo vacío en el modo mojado por ESEM preserva el estado muy natural de la colonia biopelícula. Sin embargo, la información sobre la morfología celular individual y EPS abundancia y la arquitectura era escasa, ya que los EPS estaban todavía completamente hidratado y las células se incrusta en el EPS (datos no mostrados). En cuanto a la deshidratación, CP-secado fue el procedimiento más riguroso. Se eliminó la mayor parte estructuralmente moléculas de agua unida y a granel a partir del tejido, lo que representa una pérdida de volumen de 30 a 70%, dependiendo del tejido 32. Por el contrario, de secado al aire conserva las moléculas de agua unidas. Un tejido embrionario por ejemplo perdió 18% de su volumen después de secado al aire de la etanol disolvente volátil y 59% después de secado CP-32 </sup&gt;. A medida que las EPS retener el agua y son muy hidratado, se recomienda considerar la pérdida completa del agua en el método CP-seca. Cuando las muestras de este estudio se deshidrataron en etanol y se secó al aire, se conservó la estructura tridimensional de la colonia biofilm, aparecieron células individuales, y se aplana los EPS, pero todavía conectada y cubría las células individuales (Figura 6A) . Colonias de biopelícula que se deshidrataron con etanol y se secaron CP-también conservan su estructura tridimensional, y las EPS se presentaron como una tela de araña (Figura 6C). En las muestras secadas al aire y CP-secado, los efectos de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina en la arquitectura colonia biofilm, la estructura única morfología celular y EPS fueron aparentes (Figura 6B y D). Las colonias de biopelículas cultivadas en presencia de D-leucina eran más pequeñas y las arrugas fueron menos pronunciadas. se alargaron Las células tratadas con D-leucina, un fenotipo que es OBSErved en las células tratadas con moléculas dirigidas a la pared celular 33. Además, las células fueron claramente menos cubiertas con las EPS y no conectados firmemente a sus células vecinas a través de los EPS como se ve en las colonias de biopelícula no tratados. Los resultados presentados muestran que los dos métodos de biofilm deshidratación colonia, a partir de etanol o secado al aire CP-secaron usando dióxido de carbono como fluido de transición dan información valiosa sobre el efecto de pequeñas moléculas sobre la morfología de células individuales, así como en la abundancia EPS y la arquitectura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig6.jpg" /> Figura 6. Las moléculas pequeñas pueden cambiar la escala grande y pequeña de la arquitectura colonia biopelícula. Biofilm colonias de B. subtilis NCIB 3610 adulto (A y D) en ausencia o (B y D) en presencia de 0,5 mM D-leucina durante 72 horas a 30 ° Cen medio MSgg sólido se fijaron como se describe en el protocolo y se seca a partir de etanol de la siguiente manera: (A y B) se secó al aire y (C y D) CP-seca utilizando dióxido de carbono como fluido de transición. Se muestran las imágenes de arriba hacia abajo binocular de las colonias de biopelícula (izquierda, paneles superiores), de arriba hacia abajo fotografías de las colonias de biopelícula secos montado en trozos de microscopía electrónica antes de oro-paladio-recubrimiento (izquierda, paneles inferiores), de baja y alta magnificación imágenes obtenidas por SEM que muestran la arquitectura 3D de las arrugas de colonias biopelícula o la organización única morfología celular / EPS. Las barras de escala de izquierda a derecha: 5 mm., 100 m, 2 micras <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.925 mM </td><td> macetafosfato monobásico assium </td></tr><tr><td> 3.075 mM </td><td> fosfato dibásico de potasio </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> 3- (morfolino N) propanosulfónico, pH 7,1 </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> cloruro de magnesio hexahidratado </td></tr><tr><td> 700 M </td><td> cloruro de calcio anhidro </td></tr><tr><td> 50 M una </td><td rowspan="2"> de hierro (III) hexahidrato de cloruro de </td></tr><tr><td> 125 M b </td></tr><tr><td> 1 M </td><td> cloruro de zinc anhidro </td></tr><tr><td> 2 micras </td><td> clorhidrato de tiamina </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> triptófano </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> fenilalanina </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> treonina </td></tr><tr><td> 0,5% (v / v) </td><td> glicerol anhidro </td&gt; </tr><tr><td> 0.5% (w / v) </td><td> sales monosódica del ácido L-glutámico hidrato </td></tr><tr><td colspan="2"> una para el ensayo de película; b para el ensayo de biopelícula </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Composición final 1x MSgg utilizado en este estudio.

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K vistas.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria are inoculated into the wells of a 96-well microtiter plate. In the case of the planktonic assay, serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added to the bacterial suspensions. In the biofilm assay, once inoculated, the bacteria are left to form a biofilm over a set period of time. Unattached cells are removed from the wells, the media is replenished and serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added. After exposure to the antimicrobial agent, the planktonic cells are assayed for growth. For the biofilm assay, the media is refreshed with fresh media lacking the antimicrobial agent and the biofilm cells are left to recover. Biofilm cell viability is assayed after the recovery period. The MBC-P for the antimicrobial agent is defined as the lowest concentration of drug that kills the cells in the planktonic culture.&#160; In contrast, the MBC-B for a strain is determined by exposing preformed biofilms to increasing concentrations of antimicrobial agent for 24 hr. The MBC-B is defined as the lowest concentration of antimicrobial agent that kills the cells in the biofilm.

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro using a 96-well microtiter plate. Planktonic or biofilm bacteria are exposed to serial dilutions of the antimicrobial agent of choice. Viability is assayed by growth on agar plates.

Establecimiento de la concentración bactericida mínima de un agente antimicrobiano para las células planctónicas (MBC-P) y las células de biopelícula (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Interrupción Anti-virulenta de patógenos biopelículas utilizando Engineered Quórum para saciar lactonasas

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Biología

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their high resistance to most clean-in-place (CIP) procedures frequently used in processing plants. Therefore, it is imperative to develop new biofilm control strategies for the dairy industry. This protocol is aimed at evaluating the efficacy of organic peroxyacids (peracetic, perpropionic, and perlactic acids and a commercial peracetic acid-based disinfectant) for eradicating dairy biofilms using a combination of static and dynamic methods. All the disinfectants were tested on the strongest biofilm-producing bacteria in either a single or a mixed biofilm using the minimum biofilm eradication concentration (MBEC) assay, a static high-throughput screening method. A contact time of 5 min with the disinfectants at the recommended concentrations successfully eradicated both the single and mixed biofilms. Studies are currently ongoing to confirm these observations using the Center for Disease Control (CDC) biofilm reactor, a dynamic method to mimic in situ conditions. This type of bioreactor enables the use of a stainless-steel surface, which constitutes most industrial equipment and surfaces. The preliminary results from the reactor appear to confirm the efficacy of organic peroxyacids against biofilms. The combined approach described in this study may be used to develop and test new biological or chemical formulations for controlling biofilms and eradicating microorganisms.

This protocol describes an approach combining static and dynamic methods to evaluate the efficacy of organic peroxyacids for eradicating biofilms in the dairy industry. This approach may also be used to test the effectiveness of new biological or chemical formulations for controlling biofilms.

Evaluación de la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para la erradicación de biofilms lácteos utilizando un enfoque que combina métodos estáticos y dinámicos

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

Evaluación de la formación de biopelículas de Acinetobacter y caracterización de biopelículas

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autor destacado: Un protocolo integral para la cuantificación, evaluación y visualización de biopelículas de Acinetobacter 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Metodologías para el estudio

Resumen

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