Name: methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors at JoVE.com

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. Die Beurteilung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf Pellicle und Biofilm Koloniebildung <ol><li> Bereiten Sie eine 2x Lösung definierter Biofilm-induzierenden MSgg Medium 25 ohne Calciumchlorid und Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat. Nach Filtersterilisation, das Calciumchlorid hinzu. Das Medium bereit ist, direkt zu verwenden, oder es kann in der Dunkelheit bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie die 1x MSgg Verdünnungs am Tag des Experiments. <ol><li> Verdünne die 2x MSgg Medium mit sterilem destilliertem Wasser (Häutchen) oder sterile 3% heißem (80 ° C) Agar (Biofilme) und fügen Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat auf eine Endkonzentration von 50 uM (Häutchen) oder 250 &amp; mgr; M bis 1 x ( Biofilme). Fügen Sie Antibiotika oder kleine Molekül-Inhibitoren auf die gewünschte Konzentration und gut mischen. Um beispielsweise eine Endkonzentration von 0,5 mM D-leucin in 30 ml zu erhalten, Häutchen oder Biofilme zu etablieren, fügen 196,6 ul einer 76,3 mM (10 mg / ml) D-Leucin-Stammlösung. NEINTE:. Die endgültige 1x MSgg Zusammensetzung in Tabelle 1 beschrieben , ist im Vergleich zu dem Originalrezept 25 enthielt das Medium 50 ug / ml Threonin und die Eisenkonzentration Biofilm - Kolonien auf festem Medium wachsen MSgg wurde 2,5 - fach erhöht , um die faltigen Koloniemorphologie zu optimieren . </li></ol></li><li> Nach dem Erstarren des Agars, trockne die festen MSgg Platten in einer biologischen Haube für 30-45 min vor der Inokulation. </li><li> Um spezifische Inhibitoren auszuwählen , die mit den Mechanismen der Pellikelbildung (Abbildung 1) interferieren, auszuschließen , dass die verwendeten Konzentrationen beeinflussen planktonischen und statische Wachstum. <ol><li> Bestimmen planktonischen Wachstums (Zunahme der optischen Dichte über die Zeit in Flüssigkultur) in einem einfachen Wachstumskurve, die durch die optische Dichte bei 600 nm, bis die stationäre Wachstumsphase jede Stunde gemessen wird. </li><li> Um zu bestätigen, daß die gemessene Trübung Kultur lebende Zellzahlen darstellt, bestimmen die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU)von Zellen in der planktonischen Wachstumsphase aus einer Schüttelkultur nach mehreren Zeitpunkten. </li><li> Um die Wirkung von kleinen Molekül-Inhibitoren auf die statischen Häutchen Wachstum, Ernte Zellen am Ende eines 3-tägigen Inkubation bei 23 ° C von einer 24-Well-Zellkultur zu bewerten und unter den gleichen Bedingungen beimpft wie in den Abschnitten 1.7-1.9 beschrieben und bestimmen die CFU. Für diese Steuerung verwenden , um ein Häutchen-defizienten Stamm, der die Operons für die extrazelluläre Matrixkomponenten (dh B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa) fehlt. HINWEIS: Dieser Stamm ist in der Lage unter statischen Bedingungen wachsen, aber im Gegensatz zu einem Pellicle-bildenden Wildtyps ist es einen Mangel an der Fähigkeit, die Flüssigkeit-Luft - Grenzfläche zu schwimmen, wo das Wachstum durch erhöhte Sauerstoffgehalt 26 begünstigt wird. Somit ist diese extrazelluläre Matrix- und Häutchen-defizienten Stamm ist eine empfohlene Referenzstamm Wachstum unter statischen Bedingungen zu beurteilen. HINWEIS: Für die spezifische Exausreichend der nicht-kanonische D-Aminosäure D-Leucin unten beschrieben, eine Wirkung auf planktonischen und statische Wachstum bei Konzentrationen , die mit Pellikelbildung gestört wurde 12,17 ausgeschlossen. Die Methoden planktonischen und statische Wachstum zu bestimmen , sind im Detail 17 beschrieben. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Abbildung 1. Konzeptübersicht für die Identifizierung eines robusten Versuchsaufbau die spezifische Hemmung der Biofilmbildung zu bewerten. Die Auswahlkriterien für kleine Molekül - Inhibitoren , die spezifische Interferenz mit Biofilmbildung zeigen , ohne ausgeprägte Wirkung auf Planktonwachstum. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen dieser Figur.</a> <ol start="5"><li> Streak aus B. subtilis von einem -80 ° C Lager (LB culture von 10 9 Zellen / ml in 20% Glycerin eingefroren) einzelne Kolonien auf einem LB-1,5% Agar - Platte mit einer sterilen Spitze oder Applikatorstäbchen zu isolieren. </li><li> Wachsen über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Kritischste Schritt: Für eine robuste Pellicle Hemmung durch die nicht-kanonische D-Aminosäuren wie D-Leucin, zu wachsen nahm eine einzelne Kolonie von der LB-1,5% Agar - Platte in 3 ml LB - Brühe bei 37 ° C für 4 h in einem Schüttelinkubator (Schüttelgeschwindigkeit 200 Umdrehungen pro Minute). Ersetzen die LB-Brühe mit Biofilm-induzierenden MSgg Medium vor der Beimpfung durch Zentrifugieren 1,5 ml Starterkultur für 4 min bei 6000 xg, sorgfältig den Überstand zu entfernen und Resuspendieren des Pellets in 1,5 ml MSgg Medium. Der Rest der Kultur kann verworfen werden. Wichtig: Um die Robustheit des Systems zu gewährleisten, die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) der gewaschenen Starterkultur sollte zwischen 0,6 und 1 liegen. </li><li> Während des Wachstums der Starterkultur, bereiten eine 12-Well-Zellkultur Multidish Platte mit deg 3 ml MSgg Medium ohne oder mit einem Konzentrationsbereich des kleinen Molekül - Hemmstoff (beispielsweise 0,3, 0,5, 1 mM D-Leucin - 17). Um Randeffekte auszuschließen, verteilen sich die Position der verschiedenen Konzentrationen über die Multidish Platte. Alternativ können Sie auch 24-Well-Zellkulturplatten Multidish 1,5 ml MSgg Medium enthält. </li><li> Beimpfen die Vertiefungen der 12-Well-Zellkultur Multidish-Platte mit 3 ul der gewaschenen Starterkultur (1: 1000 Verdünnung). HINWEIS: Eine niedrigere Verdünnungsverhältnis, das heißt, 1: 500 verwendet werden. Dies verringert die Entwicklungszeit der Häutchen. </li><li> Wachsen die Häutchen bei 23 ° C unter statischen Bedingungen für drei Tage. Nicht die Häutchen in dieser Zeit bewegen, wie es die endgültige Oberflächenmorphologie der Pellicle beeinflussen können. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem Binokular und homogene Belichtung von Blitz. Alternativ können Sie auch ein Bild von den Häutchen mit einer hochauflösenden Kamera. Um zu vermeiden, durch inconsis verursachte ArtefakteZelt Licht Winkel und Schatten, nehmen Top-down-Bilder mit der Kamera auf einem Stativ befestigt ist und eine weiche und große Lichtquelle bei 45 ° von beiden Seiten nutzen. ANMERKUNG: Eine alternative Methode B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit ist der Biofilm - Kolonie - Assay auf festem, Biofilm-induzierenden MSgg Medium. Wie Häutchen, ermöglicht dieser Test die Untersuchung von Raum-Zeit-Prozesse. Sobald der aktive Bereich von niedermolekularen Inhibitoren bestimmt wird, deren Wirkung auf die Koloniebildung Biofilm untersucht werden. </li><li> Zur Biofilm-Kolonien wachsen, punktsymmetrisch 1,5 ul der ungewaschenen Vorkultur (Schritt 1.7) auf der getrockneten MSgg 1,5% Agar-Platte mit Hilfe einer Schablone, - 4 Tropfen pro Petrischale von 8,5 cm Durchmesser. Lassen Sie die Tropfen auf die Platte adsorbieren, bevor sie in Bewegung. HINWEIS: Die Vorlage hilft, eine gleichmäßige Verteilung der Biofilm Kolonien innerhalb des Gebiets zu erhalten, wo die Zellen gezüchtet werden. Um die Vorlage zu bereiten, die Gesamtfläche des Wachstums an der ursprünglichen Skalen ziehen, teilen sie gleich Sekteors und die Mitte markieren. Für eine Runde Petrischale von 8,5 cm Durchmesser, weist diese 14 cm 2 zu einem Biofilm Kolonie. </li><li> Inkubiere die Platten bei 30 ° C für drei Tage. Während dieser Zeit Biofilm Kolonien entwickeln und bilden eine dreidimensionale, faltige Struktur. </li><li> Nehmen Sie Bilder wie in Schritt 1.11. </li></ol> 2. Ethanol-Resistenztest <ol><li> Wachsen Biofilme wie in den Schritten 1,1-1,7 und 1,12-1,14 beschrieben. </li><li> Nach 68 h Wachstum bei 30 ° C, schneiden die Biofilm-Kolonien in zwei gleiche Teile mit Hilfe einer Rasierklinge und der Schablone. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Abbildung 2. Beispiel experimentelle Design der Beständigkeit von Biofilm Kolonie Zellen zu Sterilisationsmitteln. (A) Vorlage zur Beurteilung für die gleichmäßige Verteilung der Biofilm Kolonien in einer Petrischale verwendet und zum Schneiden. (B)Top-down-Bilder von unbehandelten Wildtyp-Biofilm für 68 Stunden auf einer soliden, definiert Biofilm-induzierenden MSgg Medium bei 30 ° C gezüchtet. Die Erweiterung zeigt, wie ein Biofilm Kolonie kann in zwei gleiche Hälften geschnitten werden. (C) Die zwei gleiche Hälften Biofilm gleich behandelt (Kontrolle, PBS) oder mit entweder PBS oder Sterilisationsmittel und wie beschrieben verarbeitet. Maßstabsbalken:. 1 cm <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Heben Sie jede Hälfte des Biofilms Kolonie von der Agarplatte mit einem kleinen Spachtel und es in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 500 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bewegen. Falls erforderlich, kratzen die verbleibenden Zellen von der Platte und übertragen sie auch auf das Reaktionsgefäß. HINWEIS: Die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie unterschiedlich behandelt wird, je nachdem, ob es die Steuerung oder den Widerstand gegen Steri zu testenlizing Mittel. </li><li> Für die Steuerung, wie in Schritt 2.3 die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie in 500 &amp; mgr; l PBS inkubiert. Zur Beurteilung der Beständigkeit gegen Sterilantien, übertragen die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie zu 500 ul 50% (v / v) Ethanol. HINWEIS: Alternative Mittel wie Natriumhypochlorit Sterilisieren verwendet werden. Für alle Sterilisationsmittel verwendet werden, die aktive Konzentration und Inkubationszeit in einem Vorversuch bestimmen. </li><li> Inkubieren der Biofilm-Kolonien für 10 min auf der Tisch bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren Sie die Biofilm Kolonien für 5 min bei 18.000 xg und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. In 300 ul PBS. </li><li> Beschallen die Zellen leicht (Amplitude 10%, Puls 5 sec) mit der Mikrospitze eines Beschallungsgerät. HINWEIS: Die Beschallungsenergie auf separaten Biofilm Aggregate ausreichend sein. Aber auch harte Beschallung kann die Zellen lysieren. Bestätigen Sie im Voraus durch Lichtmikroskopie, dass die Beschallungsenergieverwendet, um die Zellen nicht lysieren, und dass alle Aggregate gelöst sind. </li><li> Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l PBS zu einem Endvolumen von 1 ml. Führen Sie eine serielle Verdünnung (bis 10 -7) in PBS und verteilt 100 ul 3 Verdünnungen auf einem LB-1,5% Agar - Platte unter Verwendung von sterilen Glasperlen. HINWEIS: Die optimalen Verdünnungen plattiert werden sollten in einem Vorversuch bestimmt werden, wie dies hängt von der Menge von Zellen im Biofilm Kolonie von Interesse und die Überlebensrate der Zellen in Reaktion auf das Sterilisationsmittel. </li><li> Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 ° C, die CFU zählen und KBE / ml zu bestimmen. Von der letzten KBE / ml jeweils die Hälfte Biofilm Kolonien, berechnen den Prozentsatz der Überlebenden. HINWEIS: Bei durchgeführt und analysiert, wie beschrieben, die beiden Hälften des Steuer Biofilm Kolonie und der unbehandelte im Vergleich zu mit Ethanol behandelten Hälfte der unbehandelten Biofilm Kolonie sollten Unterschiede von unter 10% in Lebendzellanzahl ergeben, die Symmetrie oder den Widerstand der Kolonie Verifizieren , welche nach Süctively. Alternativ können die Ergebnisse insgesamt CFU dargestellt werden. Die Zellzahlen der Kontrolle und unbehandeltem Biofilm Kolonie sollte in der gleichen Größenordnung bleiben. Im Gegensatz dazu sind die Zellzahlen der mit Ethanol behandelten Hälfte eines kleinen Moleküls behandelten Biofilms Kolonie erwartet um mindestens zwei Größenordnungen fallen für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Sterilisationsmittel zu beanspruchen. </li></ol> 3. Biofilm Colony Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Biofilm wachsen Kolonien wie in den Schritten 1,1-1,7 und 1,12 bis 1,14 beschrieben. </li><li> Eine frische Charge von 2% (v / v) Glutaraldehyd, 3% (v / v) Paraformaldehyd-Lösung in 100 mM Natriumcacodylat, 5 mM Calciumchlorid-Puffer, pH 7,3. Bereiten Sie 5 ml Fixiermittel für jede Petrischale von 8,5 cm Durchmesser. ACHTUNG: Glutaraldehyd und Paraformaldehyd sind gefährlich. Behandeln Sie sie mit Sicherheitsausrüstung innerhalb einer chemischen Haube. Entsorgen Sie die Lösungen und die kontaminierten Materialien zur hazardous Abfälle. </li><li> Vorsichtig die Fixiermittel zu den Biofilm Kolonien, ohne direkt auf der Biofilme zu verzichten. HINWEIS: Aufgrund des hydrophoben Charakters des Biofilms Kolonie, langsam die Kolonien aus dem Agar zu lösen und zu schweben beginnen. </li><li> Dichtung sorgfältig die Platten mit einem Streifen Parafilm. Inkubieren auf einem Rotationsschüttler für 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend die Platten auf 4ºC übertragen über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem mit einer Vakuumpumpe verbunden Glaspipette Pasteur. </li><li> Vorsichtig 10 ml 100 mM hinzufügen Natriumcacodylat, 5 mM Calciumchlorid-Puffer des Biofilms und Inkubation für 5 min zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit dem Pasteur Glaspipette aus der Ecke der Platte durch vorsichtiges Pipettieren Beschädigung des Biofilms und fügen Sie frische Waschlösung zu vermeiden. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> Für die Entwässerung der Biofilm Kolonien, gehen Sie mit den folgenden Schritten: 2x 5 min in ddH 2 O; 2x 20 min in 30% Ethanol; 2x 20 min in 50% Ethanol; 2x 20 min in 70% Ethanol; 2x 20 min in 96% Ethanol; 2x 30 min in 100% -igem Ethanol. <ol><li> 15 ml Flüssigkeit für jede Petrischale von 8,5 cm Durchmesser in jedem Schritt und entfernen Sie die Flüssigkeit sorgfältig nach jeder Inkubation. </li></ol></li><li> Verwenden eines von zwei unterschiedlichen Verfahren zum Trocknen der Proben aus Ethanol. <ol><li> Für Lufttrocknung von Ethanol: <ol><li> Schneiden Sie ein Zellulosefilterpapier (Durchmesser von 9 cm) in den Quartalen. Kurz ein Viertel in 100% Ethanol versenken und dann auf sie sorgfältig zu übertragen, eine Floating-Biofilm-Kolonie. Setzen Sie den nassen Filterpapier in einer Petrischale mit einem Filterpapier ausgekleidet. Decken Sie die Petrischale und lassen Sie den Biofilm Kolonien über Nacht trocknen in einer chemischen Haube. </li></ol></li><li> Zum kritischen Punkt (CP) -TROCKENTUNNEL Kohlendioxid (CO 2) als Übergangsflüssigkeit unter Verwendung: <ol><li> Füllen Sie 75% des kritischen Punktes Trockenmaschine Kammer mit 100% Ethanol. Übertragen Sie die Proben in einen Halter, um jede Probe in die eigene chamber. Wenn nötig, schneiden Sie den Biofilm mit einer Schere in kleinere Stücke. Lassen Sie die Unterwasserproben in Ethanol während der gesamten Behandlung. Dann übertragen Sie den Halter in die Kammer und die Kammer fest schließen. </li><li> Kühlen der Kammer auf 7 ° C und Rühren beginnen. Füllen Sie die Kammer vollständig mit flüssigem CO 2. Während einer 7 min Inkubationszeit, lassen die Ethanolmischung mit dem CO 2. Dann entlädt 25% der Lösung. HINWEIS: Die Kammer unter dem Niveau der Probe nicht leer. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8.2.2 viermal. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8.2.2 fünfmal mit einer Inkubationszeit von 5 min nur. Schließlich sollte das Ethanol vollständig durch CO 2 ersetzt werden. </li><li> Während der letzten Runde leer nur 5% der Kammer. Drehen Sie das Rühren und die Kühlung ab. Starten Sie die Kammer auf 42 ° C erhitzt wird. Bei einer Temperatur von 31,1 ° C und einem Druck von 73,9 bar, die Flüssigkeit CO 2 erreicht seinen kritischen Punkt, den Zustand , in dem der gasförmige phase hat die gleiche Dichte wie die Flüssigphase des Lösungsmittels 27. Sobald die Temperatur 42 ° C erreicht, für 10 min inkubieren. Bei 42 ° C besteht das CO 2 in der Kammer als überkritisches Gas. HINWEIS: Ständig den Druck der Kammer überprüfen. Der Druck sollte nicht mehr als 120 bar bei 42 ° C. </li><li> Beginnen Sie langsam das Gas freizusetzen mit kontinuierlichen Erwärmung. Dies hält die Proben in der CO 2 -Gas - Phase und verhindert die Verformung der Probenmorphologie durch die Flüssigkeitsoberflächenspannung. Stellen Sie den Durchflussmesser bis 5 l / h durch eine Feinabstimmung das Dosierventil steuert das Messgerät. Warten, bis der gesamte Druck in der Kammer freigesetzt wird. Jetzt die Kammer geöffnet und die Proben vorsichtig aus der Halterung entfernen. </li></ol></li></ol></li><li> Mantel ein Elektronenmikroskopie Stummel mit Kohlenstoffband. Mit Hilfe einer Pinzette, übertragen sorgfältig die Biofilm Kolonien auf den Stummel. Schließen Sie jede Kolonie mit dem Stummel durch eine dünne Brücke aus dem Auto Hinzufügenbon Band, die zur Ladungsableitung unter dem Elektronenstrahl von entscheidender Bedeutung ist. In diesem Stadium behandeln die Biofilm Kolonien mit Vorsicht, da sie sehr zerbrechlich sind. Speichern der Proben in einem Exsikkator für mindestens 24 h oder bis zur Untersuchung. </li><li> Am Tag der Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop, Sputter-Beschichtung der Biofilm-Kolonien für 2 min in einem Winkel von 60º in einer Gold-Palladium-Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und drehen Sie die Proben von 120 ° dazwischen. Am Ende, Sputter-coat die Proben einmal für 3 min von oben. Die 20 nm dünnen Schicht Gold-Palladium verbessert die Leitfähigkeit und erhöht den Kontrast der Probe für die Bildgebung in der SEM. </li><li> Speichern der Proben in einem Exsikkator 28 die Rehydratisierung der Probe zu vermeiden , bis die Abbildung mit einem Rasterelektronenmikroskop 29,30. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bacillus subtilis Formen robust und stark strukturierte Biofilmen sowohl in flüssiger (Häutchen) und auf festem Medium (Kolonien). Daher dient sie als ideale Modellorganismus der Wirkungsweise von spezifischen Inhibitoren Biofilm zu charakterisieren. Auf festen Medien bilden Zellen mehrzelliger Strukturen mit charakteristischen Eigenschaften, die nicht offensichtlich in Häutchen sind, wie Falten von der Mitte zum Rand hin ausstrahlen. So sind Häutchen und Kolonien ergänzende Systeme zu studieren B. subtilis Vielzelligkeit. Das Ziel dieser Studie ist es, eine B zu entwickeln subtilis Modellsystem für die Biofilm (Häutchen und Kolonien) Hemmung. Mehrere Schritte sind für die Reproduzierbarkeit des Biofilms Störung Aufsatz kritisch. Ein erster wichtiger Schritt ist, um zu bestätigen, dass die Wirkung auf die Biofilmbildung ist nicht auf einer allgemeinen Toxizität für Bakterien in der planktonischen Lebensstil gewachsen. Dies kann durch den Vergleich der Wirkung von einer bestimmten Konzentration betrachtet werden alsMall-Molekül-Hemmstoff auf die relative Biofilm Hemmung der Wirkung dieses Moleküls auf Planktonwachstum. Eine dramatisch stärkere Wirkung auf Biofilmentwicklung kann die Identifizierung von Zielmechanismen stellen sicher, dass für die Entwicklung von Biofilmen besonders wichtig sind. Ferner zeigt die hier beschriebene Untersuchung der Bedeutung der Vorkultur Bedingungen für die Entwicklung von Häutchen und ihre Empfindlichkeit gegenüber kleinen Molekülen. Bevor die Wirkung von kleinen Molekülen Charakterisieren, reproduzierbare und robuste Versuchsbedingungen (beispielsweise Häutchen Wachstumstemperatur und der Mangel an Empfindlichkeit gegenüber der Medienzusammensetzung) , um ihre Wirkungen zu testen , sollte festgelegt werden. Um solche Zustände können die Medien der Vorkultur Zustand Wachstumsphase der Vorkultur, pre-Nährmedien Entfernung, Wachstumstemperatur und Wachstumsmedien sollte berücksichtigt werden, finden. Eine große Herausforderung, wenn ein spezifischer Inhibitor für die Biofilmbildung gefunden wird, ist quantitativ zu findenund qualitative Verfahren, welche die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren auf die Biofilmentwicklung und Widerstands charakterisieren. Hier sind zwei wichtige Methoden sind im Detail beschrieben, die verwendet werden können, um die Auswirkungen solcher Inhibitoren zu bewerten. Zuerst stellen wir eine einfache quantitative Methode, die reproduzierbar die Beständigkeit der behandelten gegenüber unbehandelten Kolonie Biofilme Bakterizide, wie Ethanol Sonde kann. Repräsentative Ergebnisse sind für die Empfindlichkeit von D-Leucin-behandelten Biofilms Kolonien auf 50% -igem Ethanol dargestellt. Allerdings kann dieser Aufsatz leicht durch die Verwendung unterschiedlicher Sterilisierungsmitteln oder Antibiotika modifiziert werden. Zweitens ist eine SEM-Verfahren im Detail beschrieben, die hochauflösende Untersuchung der Veränderungen in der Biofilm-Kolonie durch den kleinen Molekül-Hemmstoff in mehreren komplementierenden Spiegel verursacht ermöglicht: die Gesamtstruktur, die Organisation und die Abundanz der EPS-Matrix und ihre Bestandteile, und die Einzelzell-Morphologien im gesamten Biofilm. Wir stellen fest, dass zwei Methoden der dehydration (lufttrocknende von 100% Ethanol oder CP-Trocknung Kohlendioxid als Übergangsflüssigkeit verwendet wird) kann ebenso während der SEM Probenvorbereitung eines Biofilms Kolonie verwendet werden. Wichtig setzt die erfolgreiche Fixierung der Biofilmprobe stark von der Hydrophobizität des Biofilms Kolonie. Diese Hydrophobizität ist ein charakteristisches Merkmal von B. subtilis Biofilmen aufgrund der hydrophoben Oberflächenschicht 10,34. Verschiedene Ansätze wurden bisher zu untersuchen Biofilm Montage und Entwicklung mit B verwendet subtilis als Modellorganismus 35. Eine Reihe von unabhängigen Studien zeigten die Auswirkungen der Medienzusammensetzung auf Biofilmentwicklung 36-38. Bisher jedoch eine systematische Bewertung der Auswirkungen der Medienzusammensetzung auf Biofilm Hemmung war nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen fehlt. Diese Studie zeigt , dass , während die Hemmung der Pellicle B. subtilis durch kleine Moleküle empfindlich Bedingungen Kultur vor, es ist unaffected durch die Wirkungen von Temperatur und Medienzusammensetzung und somit nützlich für die systematische Bildschirme von kleinen Molekül-Inhibitoren. Außerdem haben wir eine einfache, reproduzierbare und quantitative Verfahren den Widerstand der unbehandelten oder niedermolekularer Inhibitor behandelten Biofilms Kolonien antibakterielle Mittel zu beurteilen, die derzeit in den Organismus B. Biofilm Modell fehlt subtilis. B. subtilis Biofilme in Kombination mit fluoreszierenden Reportern kann weiter entnommen werden , für kleine Moleküle als Inhibitoren zu suchen , die entweder einen speziellen Entwicklungsschritt der Biofilmbildung oder eine bestimmte Subpopulation von Zellen innerhalb des Biofilms Ziel. Die hier beschriebenen Methoden bieten keine einzelne Zelle Auflösung in Bezug auf die Genexpression innerhalb des Biofilms. Methoden für die EPS - Matrix - Gen - Expressionsanalyse innerhalb B. subtilis Biofilme auf Einzelzellebene wurden erfolgreich 39 etabliert. Bakterielle Biofilme sind Cruciasl Bedeutung in Landwirtschaft, Industrie und klinischen Umgebungen. In einem landwirtschaftlichen Kontext erhöht die Kapazität Biofilme zu bilden , die Pflanzenwirts Kolonisierung zahlreicher Pflanzenpathogene 40 und in einem klinischen Kontext sind Biofilme inhärent resistent gegenüber antimikrobiellen Mitteln 21 und stehen im Mittelpunkt vieler persistent und chronischen bakteriellen Infektionen. Darüber hinaus ist es jetzt anerkannt , dass Biofilme haben große Auswirkungen auf die Kosten für die Industrie , da sie extrem schwierig zu entfernen und 41 steuern. Somit liefert ein experimentelles Rahmen für die Untersuchung der mikrobiellen Biofilm - Inhibitoren zu entwickeln bedeutende landwirtschaftliche 42,43, 21,44 klinischen und technologischen Fortschritten 45-47. Die aktuellen Verfahren sind beschränkt B. subtilis. Wir empfehlen nach den beschriebenen quantitativen und qualitativen Konzepte als auch Biofilm-spezifischen niedermolekularen Inhibitoren in anderen Spezies zu studieren. In Ergänzung<html> Diese Studie auf ein spezifisches Beispiel für die Biofilm - Hemmung durch D-Leucin bezieht, aus mehreren spezifischen Biofilm - Inhibitoren bisher 17 veröffentlicht. Wichtig ist , dass D-Leucin bereits als Anti-Biofilm - Molekül in der Pflanzenkrankheitserreger Xanthomonas citri 48, präsentiert möglich Ähnlichkeiten zwischen Pflanzens Kolonisierung und Biofilmbildung gekennzeichnet. Biofilmbildung (Häutchen und runzelig Koloniebildung) ist auch üblich , in menschliche Krankheitserreger (zB Pseudomonas aeruginosa 49-51 und uropathogene Escherichia coli 52,53). Die beschriebenen Verfahren können ferner für bestimmte Medikamente zu suchen, entwickelt werden, die die Biofilmbildung hemmen und Biofilm-vermittelte Resistenz gegen antimikrobielle Mittel in der klinischen Forschung zu reduzieren. Insgesamt sind die hier beschriebenen Verfahren können als Grundlage verwendet werden quantitative und qualitative Konzepte zu entwickeln Biofilm-spezifischen niedermolekularen Inhibitoren bei anderen Spezies als auch zu studieren. nt &quot;&gt; Zusammenfassend stellen wir ein einfaches und nützliches Werkzeug-Box , die die möglichen Stärken und Tücken bei der Verwendung von B. subtilis zeigt Biofilm - Inhibitoren zu untersuchen.

Mehrzelligen Bakteriengemeinschaften spielen eine bedeutende Rolle in natürlichen und anthropogenen Umgebungen und kann vorteilhaft oder sehr schädlich sein. Diese mehrzelligen Kolonien werden als Biofilm bekannt ist, wobei die einzelnen Zellen in einer selbst hergestellten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Matrix eingebettet sind. Die EPS haften stark die Zellen an der Oberfläche sie besiedeln. Sie dienen als Schutzschild gegen mechanische und chemische Kräfte und schaffen einen engen Kontakt zwischen benachbarten Zellen, die Erleichterung zellulären Kommunikation 1. Ein Biofilm kann als differenzierte Gemeinschaft betrachtet werden, in denen Zellen stark regulierten verwenden, Prozesse orchestriert ihre Aktivitäten innerhalb der Gemeinschaft zu koordinieren, sowie über Artgrenzen 2-5. Der Übergang von einer planktonischen, wird freilebenden Modus des Wachstums eines Biofilms Zustand oft mit Entwicklungsprozessen verbunden. Ein gutes Beispiel ist die Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, und daher ein undomesticated Stamm dient als robuster Organismus Modell die Entwicklungsstadien, die zu Biofilmbildung zu untersuchen. In diesem Bakterium, sich in auffälliger vielzelligen Strukturen bewegliche Zellen organisieren , die spezielle Aufgaben 4 auszuführen. Eine Gruppe von Zellen, die matrix-Erzeuger sekretieren Exopolysaccharide 6, das Amyloid - Protein tasa 7,8, und die Oberfläche Hydrophobizität Protein BSLA 9,10; von denen alle mit bei der Montage der EPS 11-13. Angesichts der Fülle von Biofilmen in natürlichen und anthropogenen Nischen und die vermeintliche tödlichen Schaden, den sie verursachen können, gibt es eine dringende Notwendigkeit, Wege zu finden, ihre Bildung zu verhindern. Kleine Molekül-Inhibitoren können in der Entdeckung neuer Regulationswege unterstützen, Enzyme und Struktur der Biofilmbildung beteiligten Proteine ​​und damit fördern Einblicke in die komplexen Prozesse der vielzelligen Gemeindeversammlung. Als B. subtilis ist ein gut untersuchtes Modell für BioFilmbildung 14,15, kann es verwendet werden , um die Wirkungen verschiedener Biofilm Inhibitoren zu bewerten. Diese Studie befasst sich vier grundlegende Methoden, die für die Bewertung der Reaktion von Biofilmen zu kleinen Molekül-Inhibitoren sind der Schlüssel. Erstens, um sicherzustellen, dass diese Inhibitoren haben einen Biofilm-spezifischen Ziel, die Trennung der planktonischen Wirkung auf das Wachstum von der Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ist kritisch. Die meisten antibakterielle Mittel Zielzellen in ihre planktonischen Wachstumsphase, sondern Moleküle, die die Biofilm Lebensstil Ziel sind selten. Zusätzlich kann , wie Moleküle , die nicht toxisch nicht planktonischen Wachstum beeinflussen, können sie den Selektionsdruck begünstigt antibiotische resistente Mutanten 16 reduzieren. Wenn zum Beispiel Biofilme mit D-Aminosäuren oder bestimmten anderen Zellwand-störenden Molekülen behandelt werden, werden sie entweder gestört oder zerlegt werden , aber diese Inhibitoren leicht nur planktonischen Wachstums 12,17 beeinflussen. Im Gegensatz dazu beeinträchtigen viele Antibiotika dramatisch Planktonwachstum, mit lenig oder keine Wirkung auf die Bildung von Biofilmen 17. Zweitens, eine konsistente und robuste experimentellen Rahmen zur Gründung der Wirkung der kleinen Moleküle zu untersuchen ist von entscheidender Bedeutung. Wir haben beobachtet, dass die aktive Konzentrationsbereich von kleinen Molekül-Inhibitoren war empfindlich auf die Vorkultur Bedingungen und zu den experimentellen Aufbau die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren zu untersuchen verwendet. Verschiedene Berichte, insbesondere solche B. das Studium subtilis zeigten Variationen in dem Konzentrationsbereich , bei der D-Aminosäuren , die Bildung von Häutchen hemmen - die schwimmenden bakteriellen Biofilmen 12,17-19. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin , dass die folgenden Faktoren für Unterschiede in der aktiven Konzentrationsbereich ausmachen: Die Vorkultur Bedingungen (logarithmische 12,17 im Vergleich zu späten stationären Wachstumsphase 20), das Wachstumsmedium in der Vorkultur Zustand verwendet (reich, undefined [Luria Broth, LB] gegen definiert [Natriumglutamatglycerin, MSgg]), das Verhältnis der Inokulation und insbesondere die Entfernung des Vorkulturmediums vor der Inokulation. Die Temperatur des statischen Pellicle Wachstum zeigten eine weniger wichtige Rolle bei der Aktivitätsbereich des kleinen Molekül-Hemmstoff D-Leucin, einer repräsentativen D-Aminosäure in dieser Studie verwendet. Schließlich, nachdem die Biofilme mit spezifischen Biofilm-Inhibitoren behandelt, robust und informative Verfahren erforderlich sind, um die Auswirkungen dieser Inhibitoren auf Biofilm Fitness zu charakterisieren. Hier sind zwei Methoden, unabhängig die Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren kennzeichnen, sind im einzelnen beschrieben: (1) Die Wirkung auf die einzelnen Zellen innerhalb eines Biofilms Kolonie und ihre Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Die Zellen in Biofilmen sind in der Regel resistent gegen Antibiotika im Vergleich zu den Bakterien freilebenden 21-23. Während dieses Phänomen multifaktoriell ist, wurde die Fähigkeit der EPS - Antibiotikum Penetration zu reduzieren oft als attraktiver Erklärung 24 betrachtet </sup&gt;. Diese Methode bewertet das Überleben der vorher festgelegten Biofilm-Zellen nach der Exposition gegenüber antibakterielle Substanzen. (2) Die Wirkung auf die Biofilm-Kolonie-Architektur von der großen zur kleinen Maßstab. Biofilm-Kolonien werden durch ihre dreidimensionale Struktur und die Anwesenheit der EPS gekennzeichnet. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Veränderungen in der Zellmorphologie, Biofilm Koloniestruktur und die Architektur und die Abundanz der EPS kann aus der großen (mm) sichtbar gemacht werden, um die kleinen Maßstab (um).

<table><tbody><tr><td>Luria Broth, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 136.09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino)propanesulfonic acid</td><td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>magnesium chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Merck, 203.30 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride anhydrous</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>iron(III) chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 270.30 g/mo)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>zinc chloride anhydrous&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>thiamine hydrochloride</td><td>Sigma, 337.27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Sigma, 165.19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma, 119.12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glycerol anhydrous</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid monosodium salts hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucine</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>ethanol anhydrous</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>circular cellulose filter papers</td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMS, 16% in water</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Merck, 214.05 g/mol&amp;nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride 2-hydrate</td><td>Merck, 147.02 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1172113</td><td></td></tr><tr><td>stub-aluminium mount</td><td>EMS, sloted head</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>carbon adhesive tape</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &amp;deg;C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 30 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 23 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, 500 ml, polystyrene</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&amp;nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Critical Point Dryer</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Das Häutchen - Test ist eine Methode , die stark reguliert und dynamische Prozesse von B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit. Außerdem wird der Pellicle-Assay eine Reihe von entweder pre-starter Bedingungen oder kleine Molekülkonzentrationen in einer einzigen Zellkultur Multidish Platte in einem Experiment zum Testen geeignet. Jedoch B. subtilis Pellikelbildung ist empfindlich für die Vorkultur Bedingungen (zB Wachstumsmedium der Vorkultur und der Wachstumsphase), der Inokulation Verhältnis und die Entfernung des Vorkulturmediums. Wir daher zunächst für einen Versuchsaufbau gescreent, die uns Häutchen Hemmung durch D-Leucin zu reproduzieren erlaubt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass reproduzierbare Pellicle Hemmung durch D-Leucin erhalten werden kann, wenn die Zellen in undefinierten, reich LB Medium bis zu einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase (Einzelkolonie in 3 ml LB bei 37 ° C für 4 Stunden vorkultiviert werden unter Schütteln ), zentrifugiert und in definierten MSgg Medium resuspendierten vor einer 1: 1000 inoculatIon (3A). Wenn die Zellen in MSgg Medium zu der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (einzelne Kolonie in 1 ml LB für 2 h gezüchtet, erneut verdünnt 1: 100 bis 3 ml MSgg und bei 200 5 h bei 37 ° C unter Schütteln gezüchtet rpm), Entfernung des Vorkulturmediums hatte keine Wirkung auf die D-Leucin-Aktivität aufweisen. Zellen der stationären Wachstumsphase (einzelne Kolonie in 1 ml LB für 2 h erneut verdünnt 1: 100 bis 3 ml MSgg und gezüchtet für bis zu 20 Stunden in einer Walze bei Raumtemperatur) aufgewachsen vor und gewaschen in MSgg Medium zu Impfung waren weniger empfindlich. Jedoch könnte diese Erhöhung des Widerstands gegenüber der Pellicle Hemmwirkung von D-Leucin auf die höhere Zelldichte der Vorkultur zurückzuführen sein, die Erhöhung der Beimpfung Verhältnis. Die Beimpfung Verhältnis der Vorkultur zu dem statischen Wachstum in MSgg Medium, dh, 1: 500 oder 1: 1000, beeinflusst der Aktivitätsbereich von D-Leucin und die Zeit der Entwicklung Pellikel (3B). Pellicle-Hemmung durch D-Leucin aufgetretenbei verschiedenen Wachstumstemperaturen (23 ° C und 30 ° C, 3C). Wichtig ist, während die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber D-Leucin auf die Vorkultur Bedingungen abhängt, zeigt die Reproduzierbarkeit der Phänomene bei verschiedenen Temperaturen, die Pellicle-Hemmung durch das kleine Molekül D-Leucin robuste Eigenschaften hat. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig3.jpg" /> . Figur 3. Beispiel Ergebnisse , die die Wirkungen verschiedener Vorkultur Bedingungen auf Pellicle Hemmung durch D-Leucin zeigen mehrere Parameter wurden bewertet werden eine robuste Versuchsaufbau zu erhalten, einschließlich: (A) Entfernen von Verunreinigungen aus der Vorkultur Wachstums Medium, Wachstumsmedium der Vorkultur (rich undefinierte LB Medium oder definiert Biofilm-induzierenden MSgg Medium) (nicht gegen gewaschen gewaschen) und Wachstumszustand der Vorkultur (logarithmisch gegen stationäre Wachstumsphase), (B) Beimpfung Verhältnis (1: 1.000 gegenüber 1: 500) der Vorkultur in die endgültige Pellicle Wachstumsmedium, und (C) Wachstumstemperatur (23 ° C gegenüber 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 - Zellen wurden im Medium angegeben (LB oder MSgg) für 4 h bei 37 ° C oder bei Raumtemperatur über Nacht (o / n) unter Schütteln und Vorkulturmedium wurde durch MSgg ersetzt gezüchtet wenn angegeben (gewaschen oder nicht-gewaschen). Schließlich wurde die Starterkultur beimpft 1: 1,000, wenn nicht anders angegeben und Häutchen wurden drei Tage lang unter statischen Bedingungen bei 23 ° C gezüchtet. Top-down-Aufnahmen wurden mit einer Kamera aufgenommen. Nun Durchmesser beträgt 22 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach der Identifizierung der Vorkultur Bedingungen und einem Versuchsaufbau, die für eine reproduzierbare Aktivitätsbereich von D erlaubt-Leucin auf Pellikelbildung (Vorkultur in LB zu einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet, in MSgg gewaschen, verdünnt 1: 1000 und für drei Tage bei 23 ° C gezüchtet) wurde die Wirkung für seine Robustheit getestet. Zu diesem Zweck wurde die Aktivität von D-Leucin auf Pellikelbildung in verschiedenen modifizierten MSgg Medien (4) bewertet. Der Aktivitätsbereich von D-Leucin in Pellicle Hemmung war konsistent in den fünf getesteten Medien, und zeigt, dass die Wirkung von D-Leucin auf Pellikelbildung robust ist. Ein ähnlicher Trend wurde mit D-Tyrosin beobachtet, wo Pellicle Hemmung im Konzentrationsbereich von bis zu 2 &amp; mgr; M in mehreren modifizierten MSgg Medien (geringere Eisenkonzentration und der Ersatz der Stickstoffquelle mit Ammoniumchlorid oder die Kohlenstoffquelle nicht mit Glukose, Daten übereinstimmte gezeigt). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Empfindlichkeit gegenüber D-Leucin tritt inverschiedene Wachstumsmedien. Es zeigen Top-down - Fotografien von B. subtilis NCIB 3610 Häutchen, bei 23 ° C unter statischen Bedingungen gezüchtet in definierten, Biofilm-induzierenden MSgg Medium oder in verschiedenen modifizierten MSgg Medien (Kohlenstoffquelle 0,5% Glucose, Stickstoffquelle , 0,5% (NH 4) 2 SO 4; hohe Eisen 250 uM FeCl 3; niedrige Glycerin 0,125% Glycerin) für drei Tage, mit Ausnahme der alternative Stickstoffquelle Medium (wo die Häutchen für fünf Tage gezüchtet wurden) , entweder ohne oder mit D-Leucin in den angegebenen Konzentrationen. Starterkulturen wurden bei 37 ° C für 4 Stunden gezüchtet mit in undefined, reich LB-Medium schütteln. Vor der Beimpfung wurden die Zellen durch Zentrifugation gewaschen und in dem entsprechenden Pellicle Wachstumsmedium resuspendiert. Die Starterkultur verdünnt 1: 1000, die gut Durchmesser 22 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; Eine alternative Methode zu untersuchen B. subtilis Vielzelligkeit ist der Biofilm - Kolonie - Assay auf festem MSgg Medium. Wie Häutchen, ermöglicht dieser Test die Untersuchung von Raum-Zeit-Prozesse. Sobald der aktive Bereich kleiner Molekülinhibitoren in dem Pellicle-System bestimmt wird, deren Wirkung auf Biofilm Koloniebildung untersucht werden. In dieser Studie wurden Biofilm-Kolonien verwendet, um die Wirkung von D-Leucin auf den Widerstand von Biofilm-Kolonien zu sterilisierenden Mitteln zu beurteilen, weil Biofilm Kolonien weniger zerbrechlich sind und auf dem festen Hintergrund, sie leichter zu manipulieren. Wenn behandelten Biofilms Kolonien mit D-Leucin für 10 min auf 50% Ethanol ausgesetzt werden, fällt der Anteil der überlebenden Zellen mit der unbehandelten Fraktion dramatisch im Vergleich (Bild 5). Dieses Verfahren kann weiter entwickelt werden, um die Auswirkungen von anderen kleinen Molekül-Inhibitoren und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber bakterizide Mittel zur Beurteilung (sterilllen Mittel oder Antibiotika). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel Ergebnisse von unbehandelten oder behandelten Biofilm Kolonie Widerstand gegen ein Sterilisationsmittel. Biofilm Kolonien von B. subtilis NCIB 3610 wurden bei 30 ° C für 68 Stunden auf festem, definiertem Medium gezüchtet, mit oder ohne 0,5 mM D-Leucin. Nach dem Schneiden wurde die Kolonien in zwei gleiche Hälften, eine Hälfte mit PBS (interne Kontrolle) und die andere Hälfte mit 50% Ethanol oder PBS (Kontrolle) behandelt. Nach dem milden Beschallung, serielle Verdünnung, Beschichtungs- und Zählung der koloniebildenden Einheiten wurde der Prozentsatz der Überlebenden im Vergleich zu der internen Kontrolle berechnet. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten mit den Mittelwerten von zwei (A) oder drei (B, C) repliziert und deren Standardabweichungen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier t</a>o eine größere Version dieser Figur sehen. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug , das verwendet werden kann , auf die räumliche Architektur des Biofilms Kolonie Falten zu konzentrieren, die Fülle und der Lokalisierung der EPS und Einzelzellmorphologie 31. REM-Aufnahmen erfordert Proben, die unter Hochvakuum abgebildet werden kann. Proben unter Hochvakuumbedingungen zu untersuchen, alle bulk Wassermoleküle entfernt werden, und deshalb SEM-Bildgebung erfordert die Dehydratisierung der Probe vor der Bildgebung. Alternativ können Proben unter niedrigen Vakuumbedingungen im nassen Modus durch Umgebungsrasterelektronenmikroskopie (ESEM) abgebildet werden, wobei die hydratisierte Probe sanft in dem Mikroskopkammer getrocknet wird. Um die Auswirkungen von kleinen Molekül-Inhibitoren auf die Biofilm-Kolonie-Architektur, die EPS-Organisation und Zellmorphologie, drei verschiedene Arten von Proben Dehydratation bewerten wurden verglichen: Trocknen im Mikroskop unter nassen mode Bedingungen (ESEM), luftgetrocknet aus einem Lösungsmittel oder kritischen Punkt (CP) -dried Kohlendioxid als Übergangsflüssigkeit. In unbehandelten und D-Leucin-behandelten B. subtilis Biofilm - Kolonien unterschiedlich Hydratisierung Stufen nach dem Verfahren verwendet werden konnte beobachtet. Imaging unter niedrigen Vakuumbedingungen im nassen Modus durch ESEM erhalten die sehr natürlichen Zustand des Biofilms Kolonie. Jedoch Informationen über Einzelzellmorphologie und EPS Fülle und Architektur war knapp, da die EPS noch vollständig hydratisiert waren und die Zellen wurden in den EPS eingebettet (Daten nicht gezeigt). Im Hinblick auf die Entwässerung wurde CP-Trocknung der strengsten Verfahren. Es entfernt die meisten strukturell gebundenem und bulk Wassermoleküle aus dem Gewebe, für einen Volumenverlust von 30-70% entfallen, abhängig von dem Gewebe 32. Im Gegensatz dazu erhalten Lufttrocknen der gebundenen Wassermoleküle. Ein embryonales Gewebe beispielsweise verloren 18% ihres Volumens nach dem Trocknen an der Luft aus dem flüchtigen Lösungsmittel um Ethanol und 59% nach der CP-Trocknungs 32 </sup&gt;. Da die EPS Wasser und sind sehr hydratisierte binden, empfehlen bedenkt, dass wir den vollständigen Verlust von Wasser in der CP-getrocknet Methode. Wenn die Proben dieser Studie wurden in Ethanol und luftgetrocknet dehydratisiert wurde die dreidimensionale Struktur des Biofilms Kolonie erhalten, einzelne Zellen erschienen, und die EPS wurden abgeflacht, aber sie noch verbunden und bedeckt die Einzelzellen (6A) . Biofilm Kolonien , die mit Ethanol und dehydriert waren CP getrocknet auch ihre dreidimensionale Struktur erhalten, und die EPS erschien wie ein Spinnennetz (6C). In den luftgetrocknet und CP-getrockneten Proben, die Wirkungen des niedermolekularer Inhibitor D-Leucin auf der Biofilmarchitektur Kolonie waren die Einzelzellmorphologie und EPS Struktur offensichtlich (6B und D). Der Biofilm-Kolonien in Gegenwart von D-Leucin gezüchtet waren kleiner und die Falten waren weniger ausgeprägt. Die D-Leucin-behandelten Zellen wurden verlängert, einen Phänotyp, der Obse istrved mit Zellwand-Targeting - Moleküle 33 behandelten Zellen. Zusätzlich wurden die Zellen weniger eindeutig mit den EPS bedeckt und nicht fest verbunden, um ihre Nachbarzellen über die EPS als in den unbehandelten Biofilm-Kolonien gesehen. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden der Biofilm Kolonie Dehydratation, luftgetrocknet aus Ethanol oder CP getrocknet unter Verwendung von Kohlendioxid als das Übergangsflüssigkeit geben wertvolle Erkenntnisse über die Auswirkungen von kleinen Molekülen auf Einzelzellmorphologie sowie auf dem EPS Fülle und Architektur. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig6.jpg" /> Abbildung 6. Kleine Moleküle können die großen und kleinen Maßstab der Architektur Biofilm Kolonie verändern. Biofilm Kolonien von B. subtilis NCIB 3610 grown (A und D) in Abwesenheit oder (B und D) in Gegenwart von 0,5 mM D-Leucin für 72 h bei 30 ° Cin dem Protokoll und getrocknet aus Ethanol auf festem Medium MSgg wurden wie beschrieben fixiert , wie folgend: Verwendung von Kohlendioxid als dem Übergangsflüssigkeit (A und B) luftgetrocknet und (C und D) CP getrocknet. Dargestellt sind oben binokularen Bilder der Biofilm Kolonien nach unten (links, obere Felder), von oben nach unten Fotografien der getrockneten Biofilm Kolonien montiert auf Elektronenmikroskopie Stubs vor Gold-Palladium-Beschichtung (links, untere Tafeln), Nieder- und Hoch Vergrößerung Bilder von SEM erwarb die 3D-Architektur der Biofilm Kolonie Falten oder die einzelne Zellmorphologie / EPS Organisation zu zeigen. Maßstabsbalken von links nach rechts: 5 mm . , 100 &amp; mgr; m, 2 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1,925 mM </td><td> Potassium Hydrogenphosphat </td></tr><tr><td> 3,075 mM </td><td> Kaliumhydrogenphosphat </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> 3- (N - Morpholino) propansulfonsäure, pH 7,1 </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> Magnesiumchlorid-Hexahydrat </td></tr><tr><td> 700 &amp; mgr; M </td><td> Calciumchlorid wasserfrei </td></tr><tr><td> 50 uM a </td><td rowspan="2"> Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat </td></tr><tr><td> 125 &amp; mgr; M b </td></tr><tr><td> 1 uM </td><td> Zinkchlorid wasserfrei </td></tr><tr><td> 2 uM </td><td> Thiamin-Hydrochlorid </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Tryptophan </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Phenylalanin </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Threonin </td></tr><tr><td> 0,5% (v / v) </td><td> Glycerin wasserfrei </td&gt; </tr><tr><td> 0,5% (w / v) </td><td> L-Glutaminsäure monosodium Säuresalze Hydrat </td></tr><tr><td colspan="2"> ein für Häutchen - Assay; b für Biofilm - Assay </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Abschließende 1x MSgg Zusammensetzung in dieser Studie verwendet.

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Serie: Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria are inoculated into the wells of a 96-well microtiter plate. In the case of the planktonic assay, serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added to the bacterial suspensions. In the biofilm assay, once inoculated, the bacteria are left to form a biofilm over a set period of time. Unattached cells are removed from the wells, the media is replenished and serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added. After exposure to the antimicrobial agent, the planktonic cells are assayed for growth. For the biofilm assay, the media is refreshed with fresh media lacking the antimicrobial agent and the biofilm cells are left to recover. Biofilm cell viability is assayed after the recovery period. The MBC-P for the antimicrobial agent is defined as the lowest concentration of drug that kills the cells in the planktonic culture.&#160; In contrast, the MBC-B for a strain is determined by exposing preformed biofilms to increasing concentrations of antimicrobial agent for 24 hr. The MBC-B is defined as the lowest concentration of antimicrobial agent that kills the cells in the biofilm.

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro using a 96-well microtiter plate. Planktonic or biofilm bacteria are exposed to serial dilutions of the antimicrobial agent of choice. Viability is assayed by growth on agar plates.

Etablierung der minimalen bakteriziden Konzentration eines antimikrobiellen Mittels für planktonische Zellen (MBC-P) und Biofilmzellen (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Targeting Biofilm Assoziierte<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Verwendung von Resazurin Based Drug-Anfälligkeit Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

Systematischer Ansatz zur Identifizierung neuartiger antimikrobieller und Antibiofilmmoleküle aus Pflanzenextrakten und -fraktionen zur Vorbeugung von Zahnkaries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Biologie

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their high resistance to most clean-in-place (CIP) procedures frequently used in processing plants. Therefore, it is imperative to develop new biofilm control strategies for the dairy industry. This protocol is aimed at evaluating the efficacy of organic peroxyacids (peracetic, perpropionic, and perlactic acids and a commercial peracetic acid-based disinfectant) for eradicating dairy biofilms using a combination of static and dynamic methods. All the disinfectants were tested on the strongest biofilm-producing bacteria in either a single or a mixed biofilm using the minimum biofilm eradication concentration (MBEC) assay, a static high-throughput screening method. A contact time of 5 min with the disinfectants at the recommended concentrations successfully eradicated both the single and mixed biofilms. Studies are currently ongoing to confirm these observations using the Center for Disease Control (CDC) biofilm reactor, a dynamic method to mimic in situ conditions. This type of bioreactor enables the use of a stainless-steel surface, which constitutes most industrial equipment and surfaces. The preliminary results from the reactor appear to confirm the efficacy of organic peroxyacids against biofilms. The combined approach described in this study may be used to develop and test new biological or chemical formulations for controlling biofilms and eradicating microorganisms.

This protocol describes an approach combining static and dynamic methods to evaluate the efficacy of organic peroxyacids for eradicating biofilms in the dairy industry. This approach may also be used to test the effectiveness of new biological or chemical formulations for controlling biofilms.

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

Bewertung der Bildung von Acinetobacter-Biofilmen und Charakterisierung von Biofilmen

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autor im Rampenlicht: Ein umfassendes Protokoll für die Quantifizierung, Bewertung und Visualisierung von Acinetobacter-Biofilmen 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Methodologien für das Studium

Zusammenfassung

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