Name: synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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El apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), el Grupo de Investigación de Formación GRK 2039 (financiado por la DFG) y el KIT se agradece.

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas apropiadas de seguridad que normalmente se requieren en los laboratorios de química orgánica, tales como el uso de una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. 1. Síntesis de los colorantes Nota: Ambos colorantes pueden ser sintetizados por los mismos tipos de reacción Figura 2 muestra una visión general de estas reacciones.. <ol><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) <ol><li> Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa a) <ol><li> Disolver 466 mg 4-picolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 20 ml de acetato de etilo al aceite residual y la mezcla se trata en un baño ultrasónico W 120 para 3 min. </li><li> Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N. </li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa b) <ol><li> Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 376 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 15 ml de diclorometano al residuo. </li><li> Filtrar y desechar el precipitado resultante. </li><li> Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un rotevaporador ary para obtener el producto como aceite de color marrón. </li></ol></li><li> Síntesis de 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2A, etapa c) <ol><li> Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de indol-3-carbaldehído, 1,52 g de carbonato de potasio y 2,70 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo. </li><li> Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a 50 ° C bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. </li></ol></li><li> Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) (Figura 2A, etapa d) <ol><li> Trabajar en atmósfera de argón y con exclusión de humedad. DISSOLve 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io y 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Añadir 0,07 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava tres veces con éter dietílico. </li><li> Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico. </li><li> Combinar los precipitados. </li></ol></li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (tinte 2) <ol><li> Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, etapa a) <ol><li> Disolver 715 mg 4-metilquinolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calora 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 20 ml de acetato de etilo al resto de aceite y tratar la mezcla en un baño ultrasónico 120 W durante 3 min. </li><li> Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N. </li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, la etapa b) <ol><li> Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 333 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 15 ml de diclorometano al residuo. </li><li> Filtrar y desechar el precipitado resultante. </li><li> Retire el disolvente under presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener el producto como aceite de color marrón. </li></ol></li><li> Síntesis de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2B, la etapa c) <ol><li> Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de 2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído, 0,996 g de carbonato de potasio y 1,77 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo. </li><li> Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li></ol></li><li> Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-phe nyl-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (Figura 2B, la etapa d) <ol><li> Trabajar bajo argsobre y bajo exclusión de humedad. Disolver 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io y 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz de fondo redondo equipado con condensador de reflujo. </li><li> Añadir 0,06 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava con éter dietílico tres veces. </li><li> Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico. </li><li> Combinar los precipitados. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Síntesis de las cadenas de ADN Nota: La síntesis de las cadenas de ADN se lleva a cabo utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida, como se describe por M. Caruthers 11 en un sintetizador de ADN. El funcionamiento del sintetizador se prueba antes del procedimiento sintético, y los reactivos se renuevan sinecesario. <ol><li> prearrangements <ol><li> Se disuelve el disponible comercialmente 2&#39;-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) en 1,2 ml de diluyente amidita (acetonitrilo seco adicional). Mueva la solución en el vial a un vial de sintetizador y el tornillo en el sintetizador. </li><li> Realizar una &quot;prueba de fugas&quot; (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para asegurarse de que no existe una fuga de gas argón. Si la &quot;prueba de fugas&quot; falla, el tornillo en el vial con más fuerza. </li><li> Primer la solución cU rellenando el tubo que conecta a la cámara de síntesis en fase sólida. </li><li> Lave todas las líneas con acetonitrilo. </li></ol></li><li> Síntesis de cadenas de ADN <ol><li> Utilizar el ordenador conectado a entrar en el método de secuencia de ADN y de acoplamiento, siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. La etapa de acoplamiento del bloque de construcción cU tarda 168 segundos con 7 pulsos (cada pulso son 16 l) en comparación con 40 segundos con 7 impulsos para una convencionalfosforamidita como bloques de construcción. </li><li> Montar la columna que contiene el CPG (vidrio de poro controlado) como fase sólida que se ha modificado con 1 mol de la primera base (síntesis de ADN se lleva a cabo a partir de 3 &#39;a 5&#39;) en el sintetizador. </li><li> Iniciar la síntesis de ADN en el sintetizador 11. </li></ol></li><li> Workup de cadenas de ADN sintetizadas <ol><li> Se secan las columnas con las cadenas de ADN sintetizadas bajo vacío S / N. </li><li> Utilice una pinza para abrir la columna y liberar la CPG en un vial de reacción. Añadir 700 l de solución de amoniaco acuoso concentrado para desproteger el oligonucleótido y liberar la hebra de ADN a partir de la GPC. </li><li> Cerrar el vial y aplicar una tapa de seguridad en el recipiente de reacción para evitar que se rompa, y se calienta a 50 ° C durante 18 hr. </li><li> Eliminar el amoníaco por centrifugación bajo presión reducida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Comience la filtración de GPC: Recipiente de centrifugar a 11.000 xg for 3 min. Tome sobrenadante y la transfiere en un dispositivo centrífugo con un tamaño de poro de 0,45 micras. Se centrifuga a 1.000 xg durante 4 minutos. </li><li> Mientras tanto, añadir 300 l de agua doblemente destilada a la GPC, vórtice durante 20 segundos y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min. Transferir el sobrenadante en el dispositivo de centrífuga y centrifugar a 1000 xg durante 4 min. Repita este procedimiento de lavado dos veces. </li><li> Eliminar el agua de las soluciones acuosas combinadas por centrifugación a 0,1 mbar y 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. Procedimiento de &quot;clic&quot; <ol><li> Añadir 50 l de agua doblemente destilada, 25 l de una solución de ascorbato de sodio (0,4 M en agua), 34 l de tris - [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1), 114 l de la azida (0,01 M en DMSO / tBuOH 3: 1) y 17 l de un tetrakis () de cobre (solución hexafluorofosfato de acetonitrilo I) (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1) a la muestra de ADN alquino-modificado liofilizado. </li&gt; <li> Incubar la muestra a 60 ° C durante 1,5 hr. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 150 l Na 2 EDTA (0,05 M en agua) y 450 l de acetato de sodio (0,3 M en agua) a la muestra de ADN y la transferencia a un tubo de 10 ml. </li><li> Añadir 10 ml de etanol (100%) y mantenerla en -32 ° C durante 16 horas. </li><li> buque Centrifugar durante 15 min a 1.000 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar DNA-pellet con 2 ml de etanol frío (80%). </li><li> pellet seco bajo presión reducida. </li></ol> 4. La purificación por HPLC Nota: Antes de la separación de las hebras de ADN se aseguran de que la HPLC está funcionando adecuadamente, lo suficientemente solvente está disponible y la columna está limpio. Enjuague columna con la concentración de partida de tampón / acetonitrilo. <ol><li> Se disuelve el crudo ADN precipitado en 250 l de agua doblemente destilada y la transferencia a un vial de HPLC. </li><li> Iniciar la HPLC de ejecución de 45 min con un gradiente de 0% de acetonitrilo a 15% de acetonitrilo para el tinte 1 y un gradi<html> ento de 0% de acetonitrilo al 17% de acetonitrilo para el tinte 2. Monitorear la carrera por el control de 260 nm (absorción de ADN) y 459 nm (colorante 1) o 542 nm (colorante 2). Reunir las fracciones que muestran la absorción en los dos canales de longitud de onda. </li><li> Compruebe las fracciones recogidas de la masa por la derecha asistida por matriz de ionización de desorción por láser (MALDI) espectrometría de masas usando una matriz que consiste en 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) y diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Preparar la matriz mediante la mezcla de 900 l de una solución saturada de 3-HPA en 1: 1 mezcla de acetonitrilo y agua con 100 l de una solución diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) en agua. </li><li> Pipetear 1-2 l de la sonda de ADN en el objetivo y dejar secar al aire. </li><li> Añadir 0,2 l de la matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate a la muestra y se mezcla hasta que cristaliza. </li><li> Realizar la espectrometría de masas MALDI. </li><li> Combinar las fracciones de HPLC que muestran los medios de la derecha. </li></ol></li></ol>_TITLE &quot;&gt; 5. Determinación de la concentración Nota: La concentración se determina midiendo la absorción a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS, sobre la base de los coeficientes de extinción (ε 260) de las bases de ADN y el colorante. <ol><li> Disolver el ADN en 100 - 200 l de agua doblemente destilada. </li><li> Aplicar 1 l de la solución de ADN en el UV / Vis espectrofotómetro. </li><li> Medir la absorción a 260 nm. Repetir tres veces. </li><li> Toma el valor medio para calcular la concentración de la solución. Para el cálculo de los coeficientes de extinción, utilizar ε 260 nm de las cuatro bases naturales 12 y el 260 nm ε de la UC bloque de construcción comprado (considerado como uridina natural) 12 para obtener el 260 nm ε de toda la cadena de ADN. Para colorante 1, el uso ε 260 nm = 10,200 * L * mol -1 cm -1 y 2 para el tinte, el uso ε = 260 nm 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm-1. Calcular la concentración de la solución siguiente ley de Lambert-Beers &#39;basado en los coeficientes de extinción y absorbancias medidas. 13 </li></ol> 6. Preparación de la muestra y Espectroscopía <ol><li> Preparación de muestras de una sola hebra <ol><li> Preparar separado 1 ml de 2,5 M soluciones de cada uno de los DNA1 modificado y DNA2 en NaCl 200 mM, NaP 50 mM, pH i = 7. </li></ol></li><li> Preparación de muestras de doble cadena <ol><li> Preparar 1 ml de una solución que contiene 2,5 M de DNA1 y 2,5 M de NaCl en DNA2 200 mM, NaP 50 mM I buffer, pH = 7 en un recipiente de reacción. </li><li> Fije la tapa con un tapón de seguridad y el calor a 90 ° C durante 10 min. A continuación, apague la calefacción y se deja enfriar a temperatura ambiente O / N. </li></ol></li><li> espectroscopia de absorción Nota: Para determinar la longitud de onda de excitación para la especificación de fluorescenciaLos espectros de absorción espectroscopia se registran. <ol><li> Capítulo único de mediciones <ol><li> Registrar una medición en blanco, solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP I buffer, pH = 7. </li><li> Transferir la solución preparada de DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo y registrar la absorción. Corregir la medición contra los datos en blanco. Determinar el valor máximo de absorción del colorante. </li><li> Repita para DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> La espectroscopia de fluorescencia <ol><li> Capítulo único de mediciones <ol><li> Grabar una medida en blanco que contenía NaCl 200 mM única, NaP 50 mM I buffer, pH = 7; usando la longitud de onda de excitación del tinte 1. </li><li> Transferir la solución DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo. </li><li> Registre el espectro de fluorescencia. </li></ol></li><li> Medición de doble hebra <ol><li> Transferir la solución de doble cadena en una cubeta de vidrio de cuarzo. </li&gt; <li> Registre el espectro de fluorescencia utilizando la longitud de onda de excitación del tinte 1. </li></ol></li></ol></li><li> experimentos de visualización Precaución: la protección ocular adecuada se debe usar para evitar el daño UV a los ojos! <ol><li> Para obtener una mejor comprensión de lo que los espectros registrados se muestran, irradiar las cubetas con lámparas UV de mano (Figura 5). Observe el cambio en el color de la fluorescencia de la sola con el ADN de doble cadena. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo muestra el procedimiento completo para etiquetar ADN post-sintéticamente a través de CuAAC por los tintes fluorescentes azida modificado. Esto incluye la síntesis de los colorantes y el ADN alquino-modificado, así como el procedimiento de etiquetado. La síntesis de los colorantes sigue cuatro pasos. Todos los productos pueden ser obtenidos por una precipitación bastante simple debido a su carga positiva y no se necesita cromatografía en columna consume mucho tiempo. La introducción de las funcionalidades azida antes de las etapas de acoplamiento centrales acorta las síntesis de los colorantes a cuatro en lugar de cinco pasos de reacción consecutivos. se evitaron La aplicación de 1,3-diyodopropano en lugar de 3-yodopropanol para la etapa de alquilación, la reacción de Appel y las siguientes reacciones Finkelstein para convertir la función hidroxilo en las funcionalidades yodo. Estos cambios en comparación con los procedimientos publicados nos permiten sintetizar los colorantes en escalas mayores y períodos más cortos de tiempo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Los tintes aplicados exhiben una excelente fotoestabilidad pero no la estabilidad necesaria durante la síntesis de ADN en fase sólida y diagnóstico diferencial. Por lo tanto, se eligió la estrategia de etiquetado post-sintético. Alternativamente, el etiquetado con tales colorantes preciosos durante la síntesis de ADN representa ultra-suaves de acoplamiento y desprotección condiciones (por ejemplo, la desprotección con carbonato de potasio). Esto representa una alternativa mucho más caro y requiere la síntesis de los correspondientes fosforamiditas colorante modificado como bloques de construcción de ADN o de etiquetado sobre el soporte sólido (en grano). DNA1 está etiquetado por colorante 1, el colorante donante y DNA2 por colorante 2, el colorante aceptor. Cuando DNA1 y DNA2 se hibridan ambos colorantes se meten en las proximidades. Una transferencia eficiente de la energía se observa cuando tinte 1 se excita. En principio, la interacción entre ambos colorantes excitónica puede interferir con una transferencia de energía eficiente ya que este último proceso exige la desacoplar y excitard tinte 1 y desacoplado tinte 2. La excitación de los colorantes acoplados iniciarían diferentes vías fotofísicas. 14 Nuestros estudios previos 9,15 revelaron que el aplicado disposición 3&#39;-5&#39;-diagonal de colorantes proporciona la base estructural para solamente pequeñas interacciones excitónicas entre los colorantes y transferencia de energía eficiente. La alta eficiencia de la transferencia de energía de fluorescencia demostrado permite la lectura precisa en in vitro e in vivo. Esto ofrece una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la visualización de la hibridación de ADN en las balizas moleculares, la unión de moléculas diana en aptámeros de ácidos nucleicos basados, así como la visualización de la integridad de pequeños ARN de interferencia (siRNA) dentro de las células. La principal limitación es el requisito para etiquetar ambas cadenas de ADN. En el futuro, nuestro objetivo es centrar nuestra labor en el desarrollo de sondas de oligonucleótidos doblemente marcada que llevan ambos colorantes en una hebra.

La imagen molecular representa una técnica fundamental para la comprensión de los procesos biológicos dentro de las células vivas. 1-3 El desarrollo de sondas basadas en ácidos nucleicos fluorescentes para tales aplicaciones químico-biológicas se ha convertido en un campo de investigación en expansión. Estas sondas fluorescentes tienen que cumplir con algunos requisitos para convertirse en herramientas adecuadas para imágenes de células. En primer lugar, los tintes aplicados deben exhibir fluorescencia con altos rendimientos cuánticos, los cambios grandes de Stokes y, sobre todo, las altas fotoestabilidades para permitir a largo plazo de imágenes in vivo. Y en segundo lugar, deben mostrar una lectura de fluorescencia fiable. Convencional cromóforo-extintor-sistemas se basan en la lectura de un solo color fluorescencia mediante simples cambios en la intensidad de fluorescencia. 4 Este enfoque conlleva el riesgo de resultados positivos falsos o negativos falsos debido a la autofluorescencia de los componentes intracelulares o baja relación señal-ruido debido a enfriamiento no deseado por otro comcomponentes. 4 Recientemente hemos informado sobre el concepto de &quot;semáforos&quot; de ADN que muestran lecturas de fluorescencia de dos colores mediante el uso de dos cromóforos diferentes. 5-6 El concepto se basa en la transferencia de energía (ET) a partir del colorante donante al colorante aceptor que cambia la fluorescencia Color (ver Figura 1). Esto permite una lectura más fiable y por lo tanto proporciona una poderosa herramienta para sondas de imagen fluorescentes. Etiquetado de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes se puede lograr mediante dos enfoques diferentes. Los colorantes se pueden incorporar durante la síntesis química de ADN sobre una fase sólida mediante el uso de bloques de construcción de fosforamidita correspondientemente modificados. 7 Este método se limita a colorantes que son estables bajo condiciones de fosforamidita y desprotección estándar. Como alternativa, las metodologías de modificación post-sintéticos fueron establecidos en la química de oligonucleótidos. Aquí, demostramos la síntesis de una de nuestras nuevas fotosenergía tabla de pares de transferencia de 8,9 y el etiquetado de post-sintética de ADN mediante el uso de cobre-1,3-catalizada cicloadición entre azidas y alquinos (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

En este protocolo, se demuestra un método para la síntesis de 2&#39;-alquino modificado hebras ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntesis en fase sólida automatizada usando química de fosforamidita estándar. Los oligonucleótidos se post-sintéticamente etiquetados por dos nuevos tintes de cianina fotoestables utilizando catalizada por cobre click-química. La síntesis tanto de tinte donador y el aceptor se describe y se realiza en tres pasos consecutivos. Con el ADN como la arquitectura circundante, estos dos colorantes se someten a una transferencia de energía cuando se ponen en estrecha proximidad por hibridación. Por lo tanto, la hibridación de dos cadenas de ADN de cadena sencilla se visualiza mediante un cambio de color de la fluorescencia. Este cambio de color se caracteriza por espectroscopia de fluorescencia, pero también puede ser observada directamente mediante el uso de una lámpara de ultravioleta de mano (UV). El concepto de una lectura de fluorescencia de dos colores hace que estas sondas de oligonucleótidos excelentes herramientas para imágenes moleculares especialmente cuando el pho descritose utilizan colorantes tostable. De este modo, se evita que photobleaching de las sondas de formación de imágenes, y los procesos biológicos se puede observar en tiempo real para un período de tiempo más largo.

La absorción y fluorescencia espectros del ADN de una sola y de doble cadena se registran como se muestra en la Figura 4. Los espectros de absorción registrada (Figura 4 derecha) muestran la absorción máximos λ max a 465 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1) y 546 nm para DNA2 de cadena sencilla (colorante 2). El DNA1_2 recocido (tinte y tinte 1 2) muestra máximos a 469 nm y tanto 567 nm. Tanto máximos de absorción muestran un desplazamiento batocrómico, 4 nm de tinte 1 y 21 nm para el tinte 2. Estos pequeños cambios espectroscópicos son el resultado de interacciones excitónicas entre los colorantes dentro de la arquitectura de doble hélice de ADN. Los espectros de fluorescencia correspondiente (Figura 4 izquierda) exhiben máximos λ max, a 537 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1, excitación a 435 nm), a 607 nm para una solaDNA2 -cables (tinte 2, excitación a 535 nm) y a 615 nm para DNA1_2 recocido (tinte 1 y 2 de tinte, excitación a 435 nm). DNA1_2 muestra únicamente el máximo de emisión del tinte de 2 a pesar de tinte 1 es excitado selectivamente lo que evidencia que la transferencia de energía se produce de manera eficiente de tinte para teñir 1 2. Esto da una relación de contraste de emisión de 1:57. La diferencia entre hebra simple y doble es evidente comparando el color de emisión en la cubeta durante la excitación con una lámpara de UV estándar como se muestra en la Figura 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig1.jpg" /> Figura 1. Concepto básico de una transferencia de energía en el ADN. La hebra de ADN modificado donante (verde) muestra la fluorescencia a 535 nm tras la irradiación a 435 nm. Si se hibrida con la hebra contador aceptor-modificado (rojo) la resultante de doble cadena scómos únicamente la fluorescencia roja del colorante aceptor a 610 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig2.jpg" /> Figura 2. Síntesis visión general de tinte 1 y el colorante 2. La síntesis de los dos colorantes de cianina 1 (A) y 2 (B) se lleva a cabo en tres pasos consecutivos. 9 (A) a) 1,3-diyodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN 3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-diyodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN 3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; do) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 44%. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig3.jpg" /> Figura 3. Estructura de bloque de creación de Cu, colorantes 1 y 2 y secuencias de DNA1 y DNA2. Los colorantes 1 y 2 están vinculados a la posición de la ribosa la 2 &#39;por un enlazador triazol dentro de las secuencias dadas de DNA1 y DNA2. 9 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig4.jpg" /> Figura 4. Fluocencia de hebras de ADN de cadena simple y doble (izquierda) y la absorción de las cadenas de ADN de cadena sencilla y doble (derecha). Espectros de emisión de DNA1 (negro) excitado en 464 nm, DNA2 (rojo), excitado a 535 nm y 435 nm (color rosa ), y se muestran híbrido DNA1_DNA2 (azul), se excita a 435 nm. Los espectros de absorción de la DNA1 de cadena sencilla (negro), DNA2 (rojo), y el DNA1_DNA2 hebra doble hibridado (azul) se muestran en el programa de la derecha. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig5.jpg" /> Figura 5. color de emisión del ADN de cadena sencilla con colorante donante (izquierda) y el ADN de doble cadena con el donante y el colorante aceptor (derecha) durante la excitación por una lámpara UV. La imagen de la cubeta que contiene la DNA1 una sola hebra (left lateral) muestra una fluorescencia verde brillante, y la imagen de DNA1_DNA2 de doble cadena (lado derecho) muestra fluorescencia de color rojo durante la excitación por una lámpara UV a 366 nm de mano. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Nanyang Technological University

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11.1K vistas.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Investigación

Bioquímica

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Demostración de técnicas de hibridación del genoma entero matriz Genómica Comparativa

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biología

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Bioingeniería

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

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