smFISH es conocido por medir el número absoluto como ubicación subcelular de los mRNAs. Nuestro protocolo sMFISH de dos colores tiene la capacidad añadida de medir la cinética de la transcripción y la degradación del ARNm. Usando este método, muchas muestras se pueden procesar simultáneamente sin tiempo adicional o esfuerzo.
Por ejemplo, cuatro experimentos de curso de tiempo que producen 48 muestras se pueden procesar para la toma de imágenes en ocho horas. Nuestro protocolo es ampliamente aplicable para muchos genes y especies bacterianas. Para preparar resbalones de cubierta y diapositivas de vidrio para el experimento.
Utilice fórceps para colocar resbalones de cubierta y diapositivas en un frasco de Coplin que contenga 100%etanol y coloque el frasco en un baño de agua ultrasónico de catering durante 15 a 20 minutos. Al final de la sonicación lavar los portaobjetos y la cubierta se desliza de tres a cuatro veces con agua ultra pura antes de rellenar el frasco con 70% etanol y repetir la sonicación. Cuando se realicen todos los pasos de sonicación, seque los resbalones de la cubierta y se deslice con gas nitrógeno.
Coloque los resbalones de la cubierta en una caja de punta de pipeta de 1000 microlitros vacía y coloque las diapositivas en una caja de diapositivas limpia. A continuación, después de los agujeros de la caja de punta de la pipeta utilizar un marcador hidrófobo para dibujar círculos en los resbalones de cubierta y aplicar una caída de 20 microlitro de 0.1%Poly l lisina a cada uno de estos pozos. Para configurar un experimento de curso de tiempo, agregue 750 microlitros de un cultivo de E.coli de crecimiento exponencial de 20 mililitros a un tubo de cultivo de 1,5 mililitros marcado en el tiempo cero.
E inmediatamente invertir el tubo. Inducir la expresión Z de lac con 0,2 a un IPTG milimolar e iniciar un temporizador. Después de comprobar el temporizador, recopile el cultivo celular en cada punto de tiempo experimental consecutivo como se acaba de demostrar.
En el momento adecuado durante el experimento, agregue un ONPF de cinco mil millonelares al matraz para reprimir la expresión Z de lac y continúe muestreando los cultivos para realizar un seguimiento de la degradación del ARNm. Al final de la adquisición de la muestra del curso de tiempo, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos seguidas de incubación en hielo durante 30 minutos. Al final de la centrifugación de incubación las muestras para extraer el fijador y utilizar una pipeta para eliminar el sobrenadante.
Vuelva a suspender las bacterias en un mililitro de DEPC PBS y lave las células dos veces más en un mililitro de PBS FRESCO DEPC por lavado. Después del último lavado, vuelva a suspender las células en 30 microlitros de DEPC PBS fresco. Para la permeabilización de las células.
Primero agregue la muestra de cada punto de tiempo a pozos hidrófobos individuales en uno de los resbalones de cubierta de vidrio esterilizado con etanol. Y permita que las células se adhieran al resbalón de la cubierta con una incubación de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir 15 microlitros de 70% etanol a cada pocóyo.
Después de cuatro minutos, aspirar el etanol de cada pozo para que los pozos estén completamente secos. Después del lavado añadir 30 microlitros de solución de pre hibridación a cada pozo de células permeabilizadas, e incubar las células durante 30 minutos en un horno de 37 grados Centígrados. Sustituya la solución de pre hibridación por aproximadamente 30 microlitros de solución de hibridación de sondas por pozo.
Y cubra la cámara con papel de aluminio durante una incubación de dos horas en el horno de 37 grados Centígrados. Al final de la incubación utilizar una pipeta multicanal para enjuagar los pozos de tres a cinco veces con 30 microlitros de solución de lavado por pozo por lavado. Después del último lavado, incubar las células durante 15 a 30 minutos a 37 grados Celsius antes de lavar los pozos cinco veces con 30 microlitros de DEPC PBS fresco por lavado.
Después del último lavado, aspira todo el líquido de la cubierta. Y añadir cuatro microlitros de FRESCO PBS a cada pozo. Utilice fórceps para colocar cuidadosamente el resbalón de la cubierta en un lado de la muestra de vidrio esterilizado con etanol hacia abajo, y utilice goma dental de silicona para sellar los bordes del resbalón de la cubierta.
Para localizar un área de interés, seleccione el modo en vivo de imágenes de contraste de fase y manipule el joystick del escenario para cambiar el campo de visión dentro de un pozo. Localizó un área en la que la densidad de celda es óptima y ajuste el enfoque Z de modo que las imágenes de celda de contraste de fase estén enfocadas. A continuación, adquiera una imagen C cinco con una exposición de cuatro segundos, una imagen C tres con una exposición de dos segundos y una imagen de contraste de fase con una exposición de 0,2 segundos para aproximadamente 10 áreas diferentes por pozo.
Alternativamente, se puede ejecutar una adquisición NDI en la que se adquieren imágenes de contraste de fase C cinco, C tres y imágenes de contraste de fase. Cuando se hayan hecho imágenes de todos los pozos, abra una herramienta de segmentación de celdas adecuada y anhaga clic en la pila. Cargue las imágenes de contraste de fase de interés y seleccione fotogramas independientes y haga clic en calcular el perfil de fase como cero.
Para comenzar el proceso de segmentación durante el cual se identificarán las celdas y se calcularán sus contornos. Cargue los parámetros proporcionados en la carpeta GitHub y haga clic en todos los fotogramas. Al final del procesamiento, seleccione el contorno para visualizar la malla.
A continuación, en la pestaña de detección de puntos, desactive la pila, compruebe las mallas y haga clic en frotar para iniciar la identificación y cuantificación del punto en función del accesorio gaussiano D. Seleccione la carpeta que contiene las imágenes fluorescentes y el archivo de malla que se acaba de calcular a partir del procedimiento de detección de celdas e indique el nombre de archivo en el que se guardarán los resultados de la detección de puntos. A continuación, utilice el flujo de trabajo de análisis de imágenes proporcionado en GitHub para analizar las imágenes de fluorescencia.
En este campo de visión completo se pueden observar aproximadamente 500 células E.coli a una buena densidad para la segmentación celular. La morfología de las células en las imágenes de contraste de fase debe permanecer comparable a la de las células vivas con fines de segmentación. Si las células están demasiado permeabilizadas, su morfología se volverá inadecuada para la segmentación.
La distribución de las intensidades puntuales del ARNm de lac Z antes de la inducción no encaja bien con una distribución normal o Poisson debido a la presencia de manchas con altas intensidades. Cuando se induce la expresión de lac Z, la señal de cinco mRNA Z lac primo aumenta antes de que aumente la señal de ARNm Z de tres lac primo. Si la expresión del lac Z se reprime, las señales de ARNm Z de cinco y tres lac principales disminuyen.
Para obtener la tasa de alargamiento de transcripción, el aumento de las cinco y tres señales principales se ajustan con las líneas. Mientras que la tasa de degradación del ARNm se obtiene ajustando la región de descomposición con una función exponencial. Debido a que el pez de molécula única es una técnica de una sola célula, también se pueden analizar las variabilidades de células a células en la transcripción.
Además, el análisis de la colocación de cinco arnbas Z de lac primo y tres primos permite cuantificar la densidad de las polimerasas de ARN en el gen lac Z. Como las muestras de diferentes puntos de tiempo se manejan simultáneamente durante este procedimiento. Es importante mantener la muestra separada mientras están en los tubos y en el resbalón de la cubierta.
Usando esta técnica de microscopía de una sola molécula. Los investigadores ahora pueden explorar cómo la cinética de la transcripción y la degradación del ARNm están relacionadas con los números absolutos o las ubicaciones subcelulares de los ARNM.
