Name: synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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ドイツ学術協会（DFG、ワ1386 / 17-1）によって財政支援、研究研修グループGRK 2039（DFGが資金提供）およびKITは深く感謝されています。

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、毒性および発癌性があります。典型的には、実験室のコートを着て安全メガネや手袋などの有機化学研究室で必要とされるすべての適切な安全対策を使用してください。 染料の1の合成注：両方の色素は、反応の同じタイプによって合成することができる。図2は、これらの反応の概要を示します。 <ol><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）の合成 <ol><li> 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化物の合成（図2（a）は、工程a） <ol><li> 466 mgの4-ピコリンと20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残油に酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。 </li><li>濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。 </li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム（図2A、ステップb）の合成 <ol><li> 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの376ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。 </li><li>オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。 </li><li>腐敗を用いて減圧下で溶媒を除去進蒸発は、褐色の油状物として生成物を得ました。 </li></ol></li><li> 1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒド（図2A、ステップc）の合成 <ol><li>不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45グラムインドール-3-カルバルデヒド1.52グラムの炭酸カリウム2.70グラムのジメチルカーボネートを溶解します。 </li><li> 19時間130℃で混合物を攪拌します。 </li><li>その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。 </li><li>水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。 </li><li>有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下50℃で溶媒を除去します。 </li></ol></li><li> カップリングの1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）（図2A、ステップd） <ol><li>アルゴン下、湿気の排除下で働きます。 Dissol還流冷却器を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム及び48mgの1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒドまし。 </li><li> 4時間80℃に0.07ミリリットルピペリジンと熱を追加します。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li>濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>沈殿物を組み合わせます。 </li></ol></li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）の合成-4-（2-（1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（色素2） <ol><li> 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化物の合成は、（図2Bには、工程a） <ol><li> 715 mgの4 - メチルキノリン及び20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li>熱16時間85℃です。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残りの油を酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。 </li><li>濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。 </li></ol></li><li> 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムの合成（図2B、ステップb） <ol><li> 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプ​​ロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの333ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。 </li><li> 16時間85℃に加熱します。 </li><li>その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。 </li><li>残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。 </li><li>オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。 </li><li>溶剤のuを削除しますファインダー褐色の油状物として生成物を得るために、ロータリーエバポレーターを使用して圧力を減少させました。 </li></ol></li><li> 1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドの合成（図2B、ステップc） <ol><li>不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45 G 2フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒド、0.996グラムの炭酸カリウム1.77グラムのジメチルカーボネートを溶解します。 </li><li> 19時間130℃で混合物を攪拌します。 </li><li>その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。 </li><li>水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。 </li><li>有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。 </li></ol></li><li> 1-への結合（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-2-脱pheニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（図2B、ステップd） <ol><li> argの下での作業上と水分の排除下で。を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウム及び59.7 mgの1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドを溶解還流冷却器。 </li><li> 4時間80℃に0.06ミリリットルピペリジンと熱を追加します。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li>濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで三回洗浄します。 </li><li>上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。 </li><li>沈殿物を組み合わせます。 </li></ol></li></ol></li></ol> DNAストランドの2合成注：DNA合成機でM.カルザース11で説明したようにDNA鎖の合成は、固相上のホスホルアミダイト法を用いて行われます。シンセサイザーの機能は、合成手順の前にテストされ、試薬があれば更新します必要。 <ol><li> Prearrangements <ol><li>アミダイト希釈剤（余分な乾燥アセトニトリル）の1.2ミリリットルで、市販の2&#39;-O-プロパルギルdeoxyuridinephosphoramidite（CU）を溶解します。シンセサイザーバイアルにバイアルにソリューションを移動して、シンセサイザーにねじ込み。 </li><li>何のアルゴンガス漏れがないことを確認する（製造者の指示に従って）、「リークテスト」を実行します。 「リークテスト」が失敗した場合は、より緊密にバイアルにねじ込みます。 </li><li>プライム固相合成室に接続する管を充填することによりCuのソリューション。 </li><li>アセトニトリルですべての行を洗ってください。 </li></ol></li><li> DNA鎖の合成 <ol><li>製造業者のプロトコルからの指示に従って、DNA配列との結合方法を入力するように接続されたコンピュータを使用してください。 CUビルディングブロックのカップリング工程は、従来の7パルスで40秒に比べ7パルス（各パルスは16マイクロリットルである）で168秒を要しビルディングブロックとしてホスホラミダイト。 </li><li>シンセサイザーに最初の塩基（DNA合成は、3 &#39;から5&#39;から行われる）の1マイクロモルで修飾されている固相としてCPG（孔制御ガラス）を含むカラムをマウントします。 </li><li> DNA合成11上の合成を開始します。 </li></ol></li><li> 合成されたDNA鎖の後処理 <ol><li>真空O / Nの下で合成されたDNA鎖の列を乾かします。 </li><li>列を開き、反応バイアルにCPGを解放するためにピンセットを使用してください。オリゴヌクレオチドを​​脱保護し、CPGからDNA鎖を解放するために濃アンモニア水溶液700μlのを追加します。 </li><li> 18時間50℃にバイアルを閉じて、破裂を防ぐために、反応容器にセキュリティ蓋を適用し、熱。 </li><li> 30℃で30分間減圧（100ミリバール）下での遠心分離によってアンモニアを除去。 </li><li> CPGからろ過を開始します。遠心分離容器を11,000×gでFOでR 3分。上清を取り、孔径0.45μmの遠心分離装置にそれを転送します。 4分1,000×gで遠心分離します。 </li><li>一方CPG、3分間、11,000×gで20秒間遠心のための渦に蒸留水300μlを添加します。 4分間の千×gで遠心分離装置及び遠心分離に上清を移します。 2回洗浄手順を繰り返します。 </li><li> 0.1ミリバールと25°CO / Nで遠心分離することにより、合わせた水溶液から水を除去します。 </li></ol></li></ol> 3.「クリック」の手順<ol><li> 、アスコルビン酸ナトリウム溶液（水中0.4 M）を25μl、50μlの34μlのトリスを二重蒸留水を追加 - [（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3：アジ化物の1）、114μL（0.01 DMSO中のM / tBuOH 3：1）およびテトラキス17μlの（アセトニトリル）銅（I）ヘキサフルオロリン酸溶液（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3： 1）凍結乾燥されたアルキン修飾DNAサンプルへ。 </l私&gt; <li> 1.5時間、60℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li> RTに冷却します。 </li><li> DNAサンプルと10ミリリットルチューブへの転送に150μlののNa 2 EDTA（水中の0.05 M）および450μlの酢酸ナトリウム（水中の0.3 M）を追加します。 </li><li> 10ミリリットルのエタノール（100％）を加え、16時間、-32℃で保管してください。 </li><li>千×gで15分間遠心分離容器、上清を除去します。 </li><li> 2ミリリットルの冷エタノール（80％）でDNAペレットを洗浄します。 </li><li>減圧下で乾燥したペレット。 </li></ol> 4. HPLC精製注：HPLCは正常に動作していることを確認するDNAの鎖を分離する前に、十分な溶媒が利用可能で、列がきれいです。バッファ/アセトニトリルの出発濃度でカラムを洗浄します。 <ol><li>二重蒸留水250μlの粗DNAペレットを溶解し、HPLCバイアルに移します。 </li><li>染料1およびgradiのためにアセトニトリルの15％、0％アセトニトリルの勾配で45分のHPLCの実行を開始します<html>色素2のアセトニトリルの17％、0％のアセトニトリルの耳鼻咽喉科を、260nm（DNA吸収）と459 nmの（染料1）または542 nmの（色素2）をチェックすることによって実行を監視します。両方の波長チャネルでの吸収を示し、それらの画分を収集します。 </li><li> 3-ヒドロキシ酸（3HPA）とdiammoniumhydrogencitrateからなる行列を使用して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法によって権利質量のために集めた画分を確認してください。 <ol><li>水中のdiammoniumhydrogencitrate溶液（100グラム/ L）100μlのアセトニトリルと水の1：1混合物に飽和3-HPA溶液を900μLを混合することにより、マトリックスを準備します。 </li><li>ターゲット上のDNAプローブのピペット1-2μlを、空気にそれを乾燥させてください。 </li><li>サンプルに3-HPA / diammoniumhydrogencitrate行列の0.2μlを添加して、それが結晶化するまで混合します。 </li><li> MALDI質量分析を実行します。 </li><li>右の質量を示すそれらのHPLC画分を兼ね備えています。 </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5。濃度​​の決意注：濃縮は、DNA塩基と色素の吸光係数（ε260）に基づいて、UV /可視分光光度計を用いて260nmでの吸収を測定することによって決定されます。 <ol><li>二重蒸留水200μlの - 100でDNAを溶解します。 </li><li> UV /可視分光光度計でのDNA溶液1μlを適用します。 </li><li> 260nmの吸収を測定します。 3回繰り返します。 </li><li>溶液の濃度を計算するために平均値をとります。吸光係数の計算のために、全体のDNA鎖のεの260nmのを得るために4つの天然塩基12のε260nmのと（自然ウリジンとみなす）を購入ビルディングブロックCUのεの260nmの 12を使用します 。染料1については、使用率ε260nmの = 10200のL *モル-1 * cm -1で色素2、使用率ε260nmの = 13100のL *モル&lt;SUP&gt; -1 * cm -1で。吸光係数と測定された吸光度に基づいて、ランバート・ベールの法則以下の溶液の濃度を計算する。13 </li></ol> 6.サンプル調製と分光<ol><li> 一本鎖サンプルの調製 <ol><li> 200mMのNaCl、50mMののNaP iはバッファに変更されたDNA1とDNA2の各2.5μMのソリューションの個別に1ミリリットルのpH = 7を準備します。 </li></ol></li><li> 二本鎖サンプルの調製 <ol><li>反応容器中で200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7にDNA2の2.5 DNA1のμM、2.5μMを含む溶液の1ミリリットルを準備します。 </li><li> 10分間90°Cに安全キャップと熱で蓋を固定します。その後、加熱をオフにして、RT O / Nまで冷却することができます。 </li></ol></li><li> 吸光分光法 注：蛍光スペックの励起波長を決定するにはtroscopy吸収スペクトルが記録されています。 <ol><li> 一本鎖の測定 <ol><li>唯一の200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7を含むブランク測定を記録します。 </li><li> 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1の調製した溶液を移し、吸収を記録します。ブランクデータに対する測定を修正してください。色素吸収の最大値を決定します。 </li><li> DNA2のために繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li> 蛍光分光法 <ol><li> 一本鎖の測定 <ol><li>唯一の200mMのNaCl、 私はバッファ50 mMの仮眠を含むブランク測定を記録し、pH = 7に。色素1の励起波長を使用して。 </li><li> 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1ソリューションを転送します。 </li><li>蛍光スペクトルを記録します。 </li></ol></li><li> 二本鎖の測定 <ol><li>石英ガラスキュベットに二本鎖のソリューションを転送します。 </l私&gt; <li>染料1の励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。 </li></ol></li></ol></li><li> 可視化実験 注意：適切な眼の保護が目に紫外線によるダメージを回避するために着用する必要があります！ <ol><li>記録されたスペクトルが表示されているものをよりよく理解するために、携帯型UV-ランプ（ 図5）でキュベットを照射します。二本鎖DNAへのシングルからの蛍光色の変化を観察します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、アジド修飾された蛍光色素によりCuAAC経由して、DNA合成後に標識するための完全な手順を示しています。これは、染料およびアルキン修飾DNAの合成と同様にラベリング手順を含みます。 色素の合成は、4つのステップに従います。すべての製品は、それらの正電荷のためにではなく、簡単な沈殿によって得ることができ、何時間のかかるカラムクロマトグラフィーは必要ありません。中央のカップリング工程の前にアジド官能基の導入は、4の代わりに、5つの連続反応工程への色素の合成を短縮します。 1,3-ジヨードプロパンの代わりに、アルキル化工程、アペル反応およびヨード機能にヒドロキシル官能基を​​変換するには、次のフィンケルシュタイン反応のための3-ヨードプ​​ロパノールの適用は回避されました。公表された方法と比較してこれらの変更は、私たちは、より大きなスケールと時間の短い期間で色素を合成することができます。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;適用される色素は、優れた光安定性ではなく、固相DNA合成および後処理時に必要な安定性を示します。このため、合成後標識戦略が選ばれました。あるいは、DNA合成の間にそのような貴重な色素で標識超軽度のカップリングおよび脱保護条件（炭酸カリウムで、例えば、脱保護）を表します。これはかなり多くの安価な代替を表し、固体支持体（ビーズ上）上のDNAビルディングブロックまたはラベリングなどの対応する色素で修飾されたホスホルアミダイトの合成を必要とします。 DNA1は、色素2、アクセプター色素により色素1、ドナー色素、及びDNA2によって標識されます。 DNA1とDNA2がアニールされる場合には両方の色素が近接に入ります。染料1が励起されたときに、効率的なエネルギー転移が観察されます。原則として、両方の色素間の励起子相互作用は、後者の方法は、非結合を必要とするので、効率的なエネルギー移動を妨害し、励起することができます結合された染料のd色素1及び非結合染料2励起は異なる光物理的経路を開始することになる。14我々の以前の研究9,15は染料の適用3&#39;-5&#39;-対角配置が間少しだけ励起子相互作用のための構造的基礎を提供することを明らかにしました染料と効率的なエネルギー移動。 実証エネルギー伝達の高効率は、in vitroおよびin vivo実験で正確な蛍光読み出しを可能にします。これは、細胞内の核酸ベースのアプタマーと同様に低分子干渉RNA（siRNA）の整合性の可視化で標的分子の結合は、分子ビーコンでDNAハイブリダイゼーションの可視化などのアプリケーションの広い範囲を、提供しています。主な制限は、両方のDNA鎖を標識するための要件です。今後は、一方の鎖の両方の色素を担持する二重標識オリゴヌクレオチドプローブの開発に私たちの仕事を集中することを目指しています。

分子イメージングは、生きた細胞内の生物学的プロセスを理解するための基本的な技術を表している。1-3、化学、生物学的応用のための蛍光核酸ベースのプローブの開発が拡大する研究分野となっています。これらの蛍光プローブは、細胞イメージングのために適したツールとなるために、いくつかの要件を満たす必要があります。まず、適用される染料は、in vivoイメージングに長期を可能にするために、高い量子収率、大きなストークスシフトと、最も重要なのは、高いphotostabilitiesで蛍光を示すべきです。そして第二に、彼らは信頼性の高い蛍光読み出しを示すべ​​きです。従来の発色団-消光剤、システムは、蛍光強度の簡単な変更によって、単一の蛍光色の読み出しに基づいている。4このアプローチは、細胞内の成分の自己蛍光または低い信号対雑音比に起因する偽陽性または偽陰性結果のリスクを負います他のCOMによって望ましくない消光によるものンポーネント。4 我々は最近、二つの異なる発色団を使用して二重蛍光色の読み出しを示す「DNAの交通信号灯」の概念に報告した。5-6概念は蛍光を変更するアクセプター色素にドナー色素からのエネルギー移動（ET）に基づいています色（ 図1参照）。これは、より信頼性の高い読み出しを可能にし、それによって蛍光イメージングプローブのための強力なツールを提供します。蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドの標識には、2つの異なるアプローチによって達成することができます。染料は、それに応じて修正されたホスホルアミダイトビルディングブロックを使用して、固相に化学的DNA合成の間に組み込むことができる。7、この方法は、標準的なホスホルアミダイトおよび脱保護条件下で安定であり、色素に限定されます。別の方法として、合成後修飾方法は、オリゴヌクレオチドの化学的性質に設立されました。ここでは、私たちの新しい写真の1の合成を実証しますテーブルのエネルギー伝達対8,9とアジドとアルキン（CuAAC）間の銅触媒1,3-付加環を使用して、DNAの合成後の標識。10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

このプロトコルでは、我々は、2&#39;-アルキンの合成のための方法を示す標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動化固相合成によってデオキシリボ核酸（DNA）鎖を修飾。オリゴヌクレオチドは合成後の銅触媒によるクリックケミストリーを使用して、2つの新しい光安定シアニン色素によって標識されています。両方のドナーとアクセプター色素の合成が記載されており、三つの連続工程で行われます。それらはハイブリダイゼーションにより近接させられるときに、周囲のアーキテクチャとしてDNAと、これら2つの色素が、エネルギー移動を受けます。したがって、2つの一本鎖DNA鎖のアニーリングは、蛍光色の変化によって視覚化されます。この色の変化は、蛍光分光法によって特徴付けられるだけでなく、直接ハンドヘルド紫外線（UV）ランプを使用して観察することができます。デュアル蛍光色読み出しの概念は、これらのオリゴヌクレオチドプローブを分子イメージング特に記載フォーのための優れたツールを作りますtostable染料が使用されています。これにより、イメージングプローブの光退色を防止し、かつ生物学的プロセスは、より長い期間のために実時間で観察することができます。

図4に示すように、一本鎖および二本鎖DNAの吸収および蛍光スペクトルが記録されています。 記録された吸収スペクトル（ 図4右）一本鎖DNA1（染料1）と一本鎖DNA2（色素2）のために546 nmのための465 nmでのショーの吸収極大λmaxを。アニールDNA1_2（染料1＆染料2）は、469 nmおよび567 nmの両方で最大値を示しています。両方の吸収極大は、これらの小さな分光変化、色素2用染料1および21 nmのための4nmの深色シフトを示す二重らせんDNAアーキテクチャ内の色素間の励起子相互作用の結果です。 単一のための607 nmにおける対応する蛍光スペクトルの一本鎖DNA1（染料1、435 nmでの励起）のために537 nmの（左図4）展示極大λmaxの、-stranded DNA2（染料2、535 nmでの励起）およびアニールDNA1_2ための615 nmで（染料1＆435 nmで2、励起色素）。染料1は、エネルギー移動これは1：57の発光コントラスト比を与える2を染めるための染料1から効率的に発生していることを証明する選択的に励起されたもののDNA1_2は、単に色素2の発光最大値を示しています。 図5に示すように、単一及び二本鎖との間の差は、標準的なUVランプによる励起時に、キュベット中の発光色を比較することにより明らかです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig1.jpg" /> DNAにおけるエネルギー伝達の 図1. 基本的な考え方。ドナー修正されたDNA鎖（緑）は、435 nmの照射により535nmで蛍光を示しています。それが得られた二本鎖のアクセプターで修飾されたカウンタ鎖（赤）とハイブリダイズされている場合ノウハウ610 nmでアクセプター色素の唯一の赤色蛍光。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig2.jpg" /> 図2は、 合成色素1および色素2.2つのシアニン色素1（A）の合成及び2（B） の概要は、次の 3つの連続工程で行われる。 図9（A）a）の1,3-ジヨードプロパンを、CH 3 CN、85℃、16時間、94％。 B）のNaN 3、CH 3 CN、85℃、16時間、87％。 c）K 2 CO 3、炭酸ジメチル、DMF、130℃、19時間、89％。 D）ピペリジン、EtOH中、80℃、4時間、80％。 （B）A）1,3-ジヨードプロパン、CH 3 CN、85℃、16時間、49％。 B）のNaN 3、CH 3 CN、85℃、16時間、93％。 C言語）K 2 CO 3、炭酸ジメチル、DMF、130℃、19時間、98％。 d）のピペリジン、エタノール、80℃、4時間、44％が。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig3.jpg" /> CU-ビルディングブロックの 図3 の構造、染料1及び2とDNA1とDNA2の配列を。染料1及び2は、DNA1とDNA2の与えられた配列内のトリアゾールリンカーにより、リボースの2 &#39;位に結合されている。9 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig4.jpg" /> 図4 のFluo一本鎖及び二本鎖DNA鎖（左）と一本鎖および二本鎖DNA鎖（右）の吸収のrescence。DNA1の発光スペクトル（黒）464 nmで励起し、DNA2（赤）、535 nmおよび435 nmで励起された（ピンク）、および435 nmで励起DNA1_DNA2ハイブリッド（青）が、示されています。一本鎖DNA1（黒）、DNA2（赤）、およびハイブリダイズした二本鎖DNA1_DNA2（青）の吸収スペクトルは、右側のショーに表示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig5.jpg" /> UVランプによる励起時にドナー色素（左）と、ドナーとアクセプター色素（右）との二本鎖DNAと一本鎖DNAの 図5. 発光色。一本鎖DNA1を含むキュベットの画像（LEFT側）は、明るい緑色の蛍光を示し、二本鎖DNA1_DNA2（右側）の画像は、366 nmでのハンドヘルドUVランプによる励起時に赤色蛍光を示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

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11.1K ビュー.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

生化学

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

生物学

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

生物工学

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

要約

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この動画の章

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた大腸菌における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

要約

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赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた大腸菌における空間と時間におけるmRNA運動学の探査