La aplicación de la cápsula endoscópica de alta definición controlada a distancia en el examen de la vejiga canina

Aquí, presentamos un protocolo para examinar la vejiga canina utilizando un endoscopio de cápsula de alta definición, implantado quirúrgicamente y maniobrado para capturar imágenes de la pared de la vejiga y la dinámica de la micción. El procedimiento ofrece información para desarrollar estudios urodinámicos precisos.

Este estudio investigó la factibilidad y las posibles aplicaciones de la cápsula endoscópica para el examen de la vejiga utilizando un modelo canino. Tres perros Beagle machos adultos se sometieron a la implantación quirúrgica de cistoscopios de cápsula y se dividieron en tres grupos, cada grupo con un Beagle: el Grupo A (Beagle A) permaneció en posición supina fija durante 8 h, el Grupo B (Beagle B) se movió libremente durante 8 h y el Grupo C (Beagle C) tuvo posiciones ajustadas manualmente (prono, supino, en cuclillas) durante 20 minutos cada uno. Los endoscopios de cápsula implantados funcionaron con éxito en todos los perros. El grupo A capturó principalmente imágenes de la base de la vejiga (6 h 27 min). El grupo B adquirió imágenes del cuello y la base de la vejiga (7 h 12 min), incluida la visualización dinámica del cuello vesical, la fosa prostática y el esfínter uretral externo durante la micción natural. El grupo C produjo imágenes del cuello, la base y el ápice de la vejiga (56 min). Los hallazgos de este estudio demuestran la capacidad de la cápsula endoscópica para proporcionar imágenes dinámicas y de alta calidad de la pared de la vejiga canina y sugieren su potencial para desarrollar evaluaciones precisas y urodinámicas.

La cistoscopia transuretral, una herramienta diagnóstica común en cirugía urológica, es ampliamente utilizada clínicamente no solo como un método confiable para el diagnóstico del cáncer de vejiga, sino también como un medio importante para el tratamiento y el seguimiento postoperatorio¹. Sin embargo, el examen cistoscópico tradicional, ya sea rígido o flexible, a menudo causa molestias a los pacientes y puede llevar a complicaciones como daño uretral e infección retrógrada². Además, las pruebas urodinámicas tradicionales, al alterar la actividad fisiológica normal del tracto urinario y las actividades mentales y psicológicas de los pacientes, introducen inevitablemente ciertos errores en los resultados ^3,4,5. Por lo tanto, el desarrollo de un método de diagnóstico miniaturizado, cómodo, sin puntos ciegos y más preciso representa una dirección futura para el avance de la cistoscopia.

La cápsula endoscópica, también conocida como endoscopia inalámbrica, se ha aplicado ampliamente en los exámenes gastrointestinales, ofreciendo beneficios como comodidad, ausencia de dolor, ausencia de infección cruzada y sin interrupción de las actividades normales del paciente. La adquisición indolora de datos completos de imágenes del tracto gastrointestinal a través de la cápsula endoscópica se ha convertido en un método estándar ^6,7,8. Dado que la vejiga es un órgano hueco conectado al medio externo a través de la uretra, se puede introducir una cápsula de tamaño adecuado en la vejiga a través de la uretra.

Con base en esto, proponemos el concepto de un cistoscopio en cápsula y exploramos sus ventajas y posibles aplicaciones como una herramienta de diagnóstico novedosa a través de experimentos con animales, proporcionando así nuevos conocimientos para el desarrollo futuro de la tecnología de endoscopia en cápsula. En este contexto, planteamos la hipótesis de que el cistoscopio de cápsula puede obtener imágenes intravesicales claras y capturar cambios dinámicos de diferentes estructuras durante el proceso fisiológico de micción, proporcionando información para el desarrollo de pruebas urodinámicas más precisas. Esto podría minimizar las molestias del paciente en el futuro y ampliar las indicaciones para los exámenes cistoscópicos.

Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital Kunshan Afiliado de la Universidad de Jiangsu, adhiriéndose estrictamente a las Directrices para la Ética y el Bienestar de los Animales de Experimentación. El número de documento de aprobación ética es 2021-06-008-K01.

1. Sujetos

1. Utilice tres Beagles machos adultos sanos para el estudio. Divídelos al azar en grupos A, B y C, con un perro por grupo.
2. Criterios de inclusión: Incluir animales de 24 meses de edad, aproximadamente 12 kg de peso y libres de enfermedades cardiovasculares, renales y otras condiciones crónicas.
3. Criterios de exclusión: Excluir animales que hayan sido sometidos a cualquier tratamiento medicinal recibido dentro de una semana antes del experimento.

2. Materiales experimentales

1. Realizar exámenes de la vejiga con un sistema de cápsula endoscópica, que incluye una cápsula inteligente de alta definición, una grabadora de imágenes y una estación de trabajo. La cápsula endoscópica mide aproximadamente 11 mm × 25 mm, captura imágenes a 2 fotogramas por segundo (FPS), funciona entre 8 y 10 horas y puede transmitir unos 60.000 fotogramas.

3. Diseño experimental

1. Preparación preoperatoria
   1. Ayune el perro Beagle durante 8 horas y retenga agua durante 2 horas antes de la cirugía.
   2. Administrar ampicilina (22 mg/kg) por vía subcutánea 30 min antes de la cirugía como antibiótico profiláctico.
   3. Retire el vello de la cara medial de la extremidad anterior izquierda y la parte inferior del abdomen con una maquinilla. Limpie el sitio quirúrgico con solución salina estéril y seque con gasa estéril. Desinfectar el sitio quirúrgico con povidona yodada.
   4. Colocar un catéter intravenoso de 20 G en la vena cefálica de la extremidad anterior izquierda. Asegure el perro Beagle a la mesa de operaciones.
2. Anestesia
   1. Monitorea los signos vitales. Administrar clorhidrato de dexmedetomidina (0,005 mL/kg) por vía intravenosa para la sedación, seguido de propofol (1,0 mL/kg) para la inducción de la anestesia.
   2. Inserte un tubo endotraqueal de 8 mm en la tráquea con un laringoscopio. Confirme la colocación correcta por auscultación y asegure el tubo con cinta adhesiva.
   3. Conecte el perro Beagle a una máquina de anestesia veterinaria y mantenga la anestesia con 1,5% a 3% de isoflurano en oxígeno por inhalación.
3. Implante de cápsula endoscópica
   1. Coloque al perro Beagle en posición supina y coloque la grabadora de imágenes cerca.
   2. Desinfecte la parte inferior del abdomen tres veces con povidona yodada y aplique paños quirúrgicos estériles.
   3. Haga una incisión longitudinal de 10 cm adyacente al pene con un mango de bisturí #3 y una cuchilla #10. Incidir la piel y los tejidos subcutáneos y diseccionar sin rodeos los músculos abdominales. Levante y retraiga el peritoneo con dos hemostáticos.
   4. Localice la vejiga y sujétela suavemente con pinzas atraumáticas. Levante y asegure la vejiga para evitar daños.
   5. Haga una incisión de 1 cm en la vejiga.
   6. Retire la cápsula endoscópica. Conecte la grabadora de imágenes a la estación de trabajo mediante el cable de bus serie universal (USB) dedicado y, a continuación, mantenga pulsado el botón de encendido de la grabadora de imágenes durante 3 segundos para encenderla.
   7. Haga doble clic en el icono OMOM Ove en el escritorio de la estación de trabajo. Introduzca el nombre de usuario y la contraseña para iniciar sesión en el software de la estación de trabajo. Haga clic en Agregar paciente e ingrese la información del Beagle, luego haga clic en Guardar.
   8. En la sección Información del paciente del software de la estación de trabajo, introduzca el número de serie del endoscopio de cápsula y el número de canal para activar la cápsula. Haga clic en Siguiente y, a continuación, haga clic en Crear nuevo caso. Cuando se le pida que formatee el dispositivo, seleccione Sí.
   9. Compruebe que la cápsula endoscópica funciona correctamente. Haga clic en Vista en tiempo real para mostrar las imágenes de la cápsula endoscópica.
      NOTA: En funcionamiento normal, la luz indicadora ACE de la grabadora de imágenes y el LED de la cápsula deben parpadear sincrónicamente.
   10. Desinfecte la cápsula endoscópica con povidona yodada y colóquela en la vejiga.
   11. Cierre la incisión de la vejiga con una sutura reabsorbible continua 4-0. Cierre las capas de la pared abdominal, luego cierre la piel con una sutura de seda 2-0. Transfiera al perro Beagle a una jaula después de la cirugía. Durante la transferencia, mantenga la grabadora de imágenes a menos de 1 m del perro Beagle para evitar la desconexión de la cápsula endoscópica.
4. Adquisición de imágenes
   1. Asegure la grabadora de imágenes en la parte superior de la jaula y garantice su seguridad.
   2. Haga clic en el botón Configuración de la estación de trabajo y, a continuación, seleccione Reiniciar grabadora de imágenes para reactivar la grabadora de imágenes y confirmar el estado de funcionamiento y la conexión de la cápsula endoscópica.
   3. Confinar al Beagle A en una jaula pequeña para perros durante 8 h para mantener la quietud. Permita que el Beagle B se mueva libremente durante 8 h.
   4. Haga que el Beagle C mantenga posiciones pronas, supinas y en cuclillas con un apoyo físico suave y observe cada posición durante 20 minutos, asegurando la comodidad del animal y minimizando la angustia.
   5. Monitoree y grabe imágenes de la vejiga de Beagle C usando la grabadora de imágenes. Haga clic en Vista en tiempo real para acceder a la transmisión de video en vivo de la cápsula y, a continuación, haga clic en el botón Iniciar grabación para iniciar la adquisición de imágenes y en el botón Detener grabación para finalizarla. Una vez que se hayan adquirido suficientes datos, presione manualmente el botón de encendido de la grabadora de imágenes para apagarla.
   6. Después de aproximadamente 8 h, cuando la luz indicadora ACT de los grabadores de imágenes de los grupos A y B haya dejado de parpadear durante 10 minutos, concluya el examen y apague los grabadores.
   7. Al final del período experimental de 8 h para los grupos A y B, después de la adquisición de la imagen para el grupo C, anestesiar nuevamente a los perros siguiendo los procedimientos descritos en la sección 3.2.
   8. Extirpación quirúrgica de la cápsula endoscópica de la vejiga mediante una cistotomía. Cierre las incisiones vesicales y abdominales como se describe en la sección 3.3.
      Permita que los perros se recuperen en jaulas limpias y tranquilas con ropa de cama suave. Administre terapia antiinfecciosa y de fluidos según sea necesario.
   9. Conecte la grabadora de imágenes a la estación de trabajo. Encienda la grabadora de imágenes e inicie sesión en el software de la estación de trabajo. Haga clic en Revisión de caso; A continuación, el sistema descargará automáticamente los datos de la imagen. Guarde los datos de la imagen en el disco duro de la estación de trabajo una vez completada la descarga.
   10. Analice los datos de imagen adquiridos.

En este estudio, cada Beagle (n = 3) recibió una cápsula endoscópica implantada quirúrgicamente en su vejiga, y todos los animales demostraron una recuperación postoperatoria normal. Los endoscopios de la cápsula funcionaron correctamente y permanecieron seguros dentro de los perros, como lo confirmaron los estudios de imagen (Figura 2). Bajo control remoto, los dispositivos capturaron imágenes claras de todas las regiones anatómicas de la vejiga en varias etapas, incluida la cúpula, la pared posterior, la pared anterior, el cuello y las paredes del lado derecho e izquierdo. En el Beagle A, el endoscopio adquirió imágenes durante 6 h y 27 min, principalmente de la base de la vejiga (Figura 2A). En el Beagle B, el endoscopio obtuvo imágenes durante 7 h y 12 min, incluyendo imágenes del cuello de la vejiga en estado de reposo (Figura 2D), después de la micción (Figura 2H) y la base de la vejiga (Figura 2I). Este grupo capturó con éxito los cambios dinámicos del esfínter uretral externo de la vesical, el cuello, la fosa prostática y el esfínter uretral externo durante el proceso fisiológico normal de micción de los perros. Las observaciones clave fueron: 1. La apertura del cuello vesical al inicio de la micción (Figura 2E). 2. Posteriormente, la expansión de la fosa prostática seguida de la apertura del esfínter uretral externo para permitir el flujo de orina (Figura 2F). 3. Después de la micción, primero se cerró el esfínter uretral externo, seguido de la fosa prostática y, finalmente, el cuello de la vejiga (Figura 2G), marcando el final de la micción (el video del proceso fisiológico de micción recogido está disponible como Video Suplementario 1). El Beagle C se colocó en decúbito prono, supino y en cuclillas durante 20 minutos cada uno, con un total de 56 minutos de adquisición de imágenes, incluidas imágenes del cuello de la vejiga (Figura 2J), la base (Figura 2K) y la cúpula (Figura 2L).

Figura 1: Proceso de inserción del endoscopio en la vejiga. (A) La incisión e inserción de la cápsula endoscópica. (B) La activación de la cápsula. (C) La sutura de la vejiga Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes obtenidas de la cápsula endoscópica y localización radiológica de la cápsula endoscópica. (A) Imagen de la base vesical del grupo A (sangrado de la sutura con bolsa). (B) Radiografía abdominal de un beagle del Grupo A que muestra la cápsula ubicada dentro de la vejiga. (C) Imagen de tomografía computarizada de un beagle en el Grupo A con la cápsula dentro de la vejiga. (D) Imagen del cuello vesical en el grupo B (estado de reposo). (E) Imagen del cuello de la vejiga de un beagle en el Grupo B dilatando, iniciando la micción. (F) Imagen de un beagle en el Grupo B que muestra el cuello de la vejiga y la dilatación de la fosa prostática, la apertura del esfínter uretral externo, la expulsión de la orina y el endoscopio de la cápsula se mueve hacia el cuello de la vejiga con el flujo de orina. (G) Imagen de un beagle en el Grupo B con el cuello de la vejiga cerrado, marcando la finalización de la micción. (H) Imagen del cuello de la vejiga después de la micción en el Grupo B. (I) Imagen de la base de la vejiga en el Grupo B. (J) Imagen del cuello de la vejiga en el Grupo C. (K) Imagen de la base de la vejiga en el Grupo C. (L) Imagen del ápice de la vejiga en el Grupo C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo complementario 1: Vídeo del proceso fisiológico de micción adquirido con el endoscopio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

En los últimos años, con el avance de la tecnología endoscópica, tanto los cistoscopios rígidos como los flexibles se han aplicado ampliamente en la práctica clínica. La aplicación convencional de la cistoscopia rígida suele ser engorrosa, con numerosos puntos ciegos y traumatismos significativos. Los pacientes experimentan un alto estrés psicológico durante el procedimiento y pueden experimentar molestias o dolor, así como respuestas fisiológicas como aumento de la frecuencia cardíaca, presión arterial elevada y reacciones de estrés psicológico⁷. La cistoscopia flexible, por otro lado, ofrece más flexibilidad en la operación, alivia la incomodidad del paciente en comparación con la cistoscopia rígida y casi elimina los puntos ciegos. Sin embargo, todavía conlleva inconvenientes, como el riesgo de infección cruzada y la susceptibilidad al daño⁹. Además, los exámenes cistoscópicos tradicionales carecen de la capacidad de observar dinámicamente el estado de la mucosa vesical durante mucho tiempo, lo que depende en gran medida de la experiencia individual del médico, lo que puede llevar a un diagnóstico erróneo. Además, debido al tiempo de exploración limitado y a los ángulos de exploración restringidos, la eficiencia diagnóstica de la cistoscopia tradicional necesita mejorar aún más^10,11. Por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente de un método de examen conveniente y sostenible.

La implantación y recuperación de la cápsula presentan desafíos significativos en este estudio. Los endoscopios en cápsula actualmente ampliamente utilizados en la práctica clínica tienen un diámetro superior a 1 cm. En nuestro experimento, la cápsula endoscópica utilizada tiene un diámetro de 1,1 cm, que es más ancho que la parte más estrecha de la uretra de un Beagle. Por lo tanto, se adoptó un procedimiento quirúrgico abierto para la implantación de la cápsula endoscópica. El diámetro medio de la uretra humana es de 5-7 mm para los machos y de 6 mm para las hembras sin dilatación, ampliándose a 1 cm tras la dilatación¹². La uretra exhibe una resistencia de cierre, lo que impide el paso de los endoscopios de cápsula actualmente disponibles a la vejiga. En consecuencia, la introducción y recuperación de una cápsula endoscópica a través de la uretra requiere un tamaño de cápsula más pequeño. Se observa que los cálculos uretrales posteriores pueden ser expulsados de la vejiga por presión hidrostática, y los cálculos pequeños pueden ser pasados a través de la uretra¹³. Inferimos que cápsulas suficientemente pequeñas podrían introducirse en la vejiga a través de un líquido o un catéter y expulsarse con la orina. Sin embargo, lograr tamaños tan mínimos con la tecnología actual parece un desafío. Dado el pequeño tamaño requerido para los endoscopios de cápsula, no es necesaria una batería de larga duración. Esto está respaldado por los hallazgos del Grupo C, donde la mayoría de las imágenes de la vejiga se adquirieron rápidamente cambiando la posición del cuerpo del Beagle. Por lo tanto, reducir el tamaño de la batería podría ser un enfoque viable para disminuir el tamaño total de los cistoscopios de cápsula en el futuro. La tecnología de carga inalámbrica también está avanzando rápidamente en varios sectores¹⁴. Además, si los desafíos del tamaño de la cápsula y la duración de la batería se pueden abordar simultáneamente en el futuro, sería posible dejar una cápsula endoscópica en la vejiga durante períodos prolongados. Esta capacidad permitiría el seguimiento a largo plazo de la recurrencia y progresión de las neoplasias malignas vesicales, lo que podría evitar a los pacientes la incomodidad de los exámenes cistoscópicos repetidos después de la cirugía de cáncer de vejiga.

En este experimento, tres grupos, designados A, B y C, obtuvieron un total de 24 h de datos de vídeo. Las imágenes del Grupo A se limitaron a vistas de la base de la vejiga; Las imágenes del Grupo B incluían vistas de la base y el cuello de la vejiga, mientras que las imágenes del Grupo C abarcaban vistas del cuello, la base y la cúpula de la vejiga. Este análisis se llevó a cabo por las siguientes razones. En los endoscopios de cápsula estándar, el extremo de la cámara (extremo frontal) es más pesado que el extremo de la cola, que contiene aire para garantizar que el extremo de la cámara permanezca alineado verticalmente con el suelo cuando está en líquido. Esto se evidenció en las imágenes del Grupo A, que se alinearon constantemente con la base de la vejiga. El experimento del Grupo B reveló que en la posición en cuclillas, la cámara estaba alineada con el cuello de la vejiga, y en la posición acostada, estaba alineada con la base de la vejiga sin capturar imágenes de la cúpula de la vejiga. En el experimento del Grupo C, colocando manualmente a los perros en posición supina, se capturaron con éxito imágenes de la cúpula de la vejiga.

La comparación de los tres grupos experimentales indica claramente que cuando los perros están en su estado natural, los endoscopios de cápsula estándar tienen puntos ciegos en su rango de observación, lo que dificulta la captura de imágenes completas. Al cambiar manualmente la posición del perro, se puede capturar la mayor parte de la pared interna de la vejiga. Para abordar la limitación de la incapacidad de los endoscopios de cápsula para moverse de forma independiente, las soluciones actuales incluyen sistemas de control magnético y sistemas de hélice accionados por motor. La cápsula magnética fue diseñada y desarrollada por primera vez por Given Imaging y ahora es ampliamente utilizada en entornos clínicos, superando la incapacidad del endoscopio de cápsula tradicional para capturar imágenes completas del estómago¹⁵. La cápsula impulsada por hélice fue desarrollada inicialmente por el laboratorio CRIM en 2009. Consta de tres partes: un controlador inalámbrico, una batería y una carcasa de soporte que contiene cuatro motores. Controlada de forma inalámbrica, la cápsula puede moverse a velocidades de hasta 7 cm/s en un estómago lleno de líquido. Se ha demostrado que las cápsulas endoscópicas equipadas con sistemas de asistencia de movimiento se mueven en un estómago lleno de líquido y capturan más del 75% de los datos de imagen¹⁶. Dado que la vejiga carece de peristaltismo y tiene un entorno interno más estable en comparación con el estómago, este sistema de asistencia al movimiento también podría aplicarse a las cápsulas de la vejiga en el futuro para obtener datos de imagen más completos de la vejiga.

Más allá de la observación de las anomalías de la vejiga, la cistoscopia permite la recuperación de materiales patológicos mediante pinzas para cuerpos extraños. En la actualidad, los endoscopios de cápsula solo poseen capacidad de observación, careciendo de los medios para realizar biopsias o intervenciones terapéuticas. Sin embargo, el desarrollo futuro de la cápsula endoscópica avanza progresivamente hacia funcionalidades operativas y terapéuticas. En 2017, Son et ^al.17. introdujo un novedoso sistema de accionamiento magnético para la cápsula endoscópica, que utiliza una aguja delgada y hueca dentro de la cápsula para perforar y aspirar tejido para la toma de muestras.

En este estudio, el Beagle B se sometió a una cápsula endoscópica exitosa, que capturó los cambios dinámicos del cuello de la vejiga, la uretra prostática y el esfínter uretral externo durante la micción. Al inicio de la micción, el cuello de la vejiga se abrió, seguido de la expansión de la uretra prostática y, finalmente, se abrió el esfínter uretral externo. Una vez concluida la micción, primero se cerró el esfínter uretral externo, luego la uretra prostática y finalmente el cuello vesical. Esto representa la primera observación de los cambios dinámicos en el complejo vesical, cuello-uretra prostática-esfínter uretral externo en caninos. Creemos que esto es importante para futuros estudios urodinámicos al introducir nuevos enfoques. Los desarrollos futuros podrían integrar sensores de presión en la cápsula endoscópica. Durante su expulsión a través de la uretra, se pueden obtener imágenes dinámicas y datos de presión de varias secciones de la vejiga y el tracto urinario. Esto reduce la interferencia con el tracto urinario y alivia el estrés psicológico de los pacientes.

Este estudio demostró la factibilidad del uso de la cápsula endoscópica para capturar imágenes de la vejiga canina, sentando las bases para su aplicación en evaluaciones urodinámicas precisas. Destaca el potencial de la monitorización dinámica a largo plazo en entornos clínicos a través de la cistoscopia con cápsula. Sin embargo, las limitaciones incluyen un tamaño de muestra pequeño y la dependencia de modelos caninos, lo que puede limitar la aplicabilidad directa a los humanos debido a las diferencias fisiológicas en los sistemas urinarios. Los desafíos técnicos a los que se enfrenta actualmente la cápsula endoscópica en los exámenes de la vejiga incluyen la miniaturización de la cápsula, la mejora de la vida útil de la batería y el perfeccionamiento de los mecanismos de control. Además, la retención prolongada de la cápsula en la vejiga puede afectar la dinámica de la micción, y las observaciones extensas de múltiples ángulos podrían generar datos voluminosos. Sin embargo, se espera que los avances continuos en tecnología e inteligencia artificial superen estos obstáculos, mejorando la precisión y la viabilidad de la cápsula endoscópica para las evaluaciones de la vejiga. En última instancia, esta investigación no solo reduce la interrupción de las funciones normales del tracto urinario durante los exámenes, sino que también fomenta el avance de las tecnologías de diagnóstico. Esto podría revolucionar las estrategias de detección temprana y tratamiento de las enfermedades de la vejiga, ofreciendo nuevas vías para la innovación médica y la atención al paciente.

Los autores no tienen nada que revelar.

Financiamiento: Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Especial de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de Kunshan (KS18062), el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Clínica de la Universidad de Jiangsu (JLY20180110) y el Proyecto de Educación Científica y Promoción de la Salud del Primer Hospital Popular de Kunshan (CXTD21-D02).

CONTRIBUCIÓN DEL AUTOR:
Yang Yuan concibió el estudio, realizó experimentos y redactó el manuscrito. Leyi Liu analizó los datos. Dingli Hu y Shihao Zhang proporcionaron recursos críticos y ayudaron con la interpretación de los datos. Bing Wang contribuyó a la revisión de la literatura y a la edición de manuscritos. Yunlong Li, como autor correspondiente, supervisó la dirección del proyecto y la finalización del manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y aprobaron la versión final del manuscrito para su publicación.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.