Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), den Fonds R01 EY029751-04 des National Eye Institute (NEI). Wir möchten uns bei Dr. Sylvia B. Smith bedanken, da es sich bei diesem Protokoll um eine modifizierte Version handelte, die auf ihrem Protokoll der Müller-Zellisolierung basierte.

Alle Tierversuche entsprachen der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und wurden nach unserem Tierprotokoll durchgeführt, das vom Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) und den Richtlinien der Universität Oakland (Protokollnummer 2022-1160) genehmigt wurde
1. Vorbereitung von Medien und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie die Müllerzell-Augenlösung her, indem Sie das Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Details in der Materialtabelle) mit Penicillin/Streptomycin in einer Verdünnung von 1:1000 ergänzen. Fügen Sie beispielsweise für 10 ml DMEM 10 μl Penicillin/Streptomycin hinzu. HINWEIS: Dies ist ein einfaches, serumfreies Medium, das vorbereitet wurde. Erwärmen Sie außerdem das gesamte Medium in einem 37 °C heißen Wasserbad, bevor Sie es für Zellkulturen verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie das komplette primäre Müller-Zellwachstumsmedium vor, indem Sie DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, hitzeinaktiviert) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen. Zum Beispiel (500 ml DMEM-Medien + 50 ml FBS + 5 ml Penicillin/Streptomycin).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,05%ige Trypsin-EDTA-Lösung mit Kollagenase IV in einer Konzentration von 200 U/ml vor (Trypsin-EDTA wird verwendet, um die berechnete Menge an Kollagenase-IV-Pulver aufzulösen, um die erforderliche Konzentration zu erreichen).</li>
</ol>2. Enukleation
<ol><li>Ethische Einschläferung der Maus durch Inhalation von CO2 gemäß den IACUC-Richtlinien.<ol><li>Setzen Sie das/die Tier(e) kurz in die CO2 -Kammer, um 100 % CO2 bei einer Füllrate von 30-70 % der Kammer Vol/min mit CO2 einzuführen, um das Ziel einer schnellen Bewusstlosigkeit innerhalb von 2-3 Minuten mit minimalem Stress für die Mäuse zu erreichen.</li>
		<li>Da sich Mäuse in einem jungen Alter (~10 Tage) befinden, führen Sie als sekundäre Methode eine Gebärmutterhalsluxation durch, um eine angemessene Euthanasie zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem Sie den Arbeitsbereich mit 70%igem Ethanol sterilisiert haben, legen Sie die Maus auf ein steriles Unterpolster.</li>
	<li>Extrahieren Sie die Augen, indem Sie die Arme der Pinzette auf den hinteren Teil des Auges legen, sanft aus dem Orbitabereich ziehen und die Augen enukleieren, indem Sie mit einer 5/45-Pinzette Druck auf den Orbitalbereich ausüben, um eine Proposis zu verursachen. HINWEIS: Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge vor der Dissektion mit 70% Ethanol, gefolgt von Phosphatpuffer-Kochsalzlösung.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Sehnerv noch mit dem Auge verbunden ist, indem Sie das Auge langsam enukleieren. Achte darauf, den Sehnerv (visuell als weißer Strang erkennbar) hinter das Auge zu ziehen. HINWEIS: Dieser Schritt muss nicht unter einem Mikroskop durchgeführt werden, sondern kann auf einer sterilisierten Bank durchgeführt werden.</li>
</ol>3. Behandlung der enukleierten Augen
<ol><li>Decken Sie ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ab und füllen Sie das Röhrchen mit 10 mL der Müller Cell Eye Lösung.</li>
	<li>Legen Sie die präparierten Augen in das 15-ml-Röhrchen mit der Müller-Zell-Augenlösung und lassen Sie sie über Nacht oder etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur ruhen.</li>
	<li>Nach 18 h die Augenlösung umfüllen und die Augen kurz mit 2-3 mL erwärmter (37 °C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ausspülen.</li>
	<li>Dekantieren Sie das PBS und bringen Sie die Augen in eine 100 mm Petrischale mit 10 ml Trypsinlösung. (vorbereitet in Schritt 1.3). HINWEIS: Trypsin wird auf das gesamte enukleierte Auge aufgetragen und wirkt als dissoziatives Mittel, um die Zelltrennung von den Netzhautschichten während der Dissektion zu erleichtern. Die präparierte Netzhaut enthält viele Zellen, darunter auch RPE-Zellen, die klebrig sind und am ehesten die Müller-Zellkulturkontaminieren können 14. Die mikroskopische Untersuchung zeigte eindeutig, dass sich nach 5 Tagen Isolation (während des ersten Medienwechsels) RPE-Zellen von der Platte lösten und13 Jahre starben. Das für die RPE-Isolierung verwendete Medium ist DMEM/F-12 mit einer anderen Zusammensetzung als DMEM (wird bei der Isolierung von Müller-Zellen verwendet und enthält Natriumpyruvat und niedrige Glukose.</li>
	<li>Stellen Sie das Gericht in einen Inkubator und inkubieren Sie es 1,5 bis 2 h bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
	<li>Nach der Inkubation werden die Augen in eine 60-mm-Petrischale mit etwa 5 ml vollständigem primärem Müller-Zell-Wachstumsmedium gegeben.</li>
</ol>4. Präparieren
HINWEIS: Dieses Verfahren muss in der sterilen Umgebung der Kulturhaube durchgeführt werden. Daher ist es unerlässlich, die Oberflächen der Haube zusammen mit allen Werkzeugen und dem Seziermikroskop gründlich mit 70%igem Alkohol zu sterilisieren. Es ist erwähnenswert, dass das Video außerhalb der Motorhaube aufgenommen wurde, um eine bessere Sichtbarkeit und klarere Demonstrationszwecke zu gewährleisten.
<ol><li>Legen Sie ein kleines Stück sterilisiertes Gewebe in Laborqualität in die Schale, um die Augen während der Dissektion zu stabilisieren. Lege die Augen unter ein Präpariermikroskop, um die Dissektion zu starten. HINWEIS: Die Verwendung von Gewebe in Laborqualität erleichtert das Manövrieren der Augen in einer mit Flüssigkeit gefüllten Schale (vollständiges Medium) und gewährleistet eine präzise Dissektion.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Vannas-Schere und eine Pinzette im M5S-Stil, um das Bindegewebe, die extraokulären Muskeln und den Sehnerv zu entfernen.<ol><li>Fassen Sie das Auge mit einer Pinzette im M5S-Stil und machen Sie mit einer Vannas-Schere oder einer Spritzennadel einen Schnitt in den Ora-Serrata-Bereich. HINWEIS: Zwischen dem vorderen und hinteren Teil des Auges befindet sich eine hellblaue kreisförmige Linie, die als Ora serrata bezeichnet wird und als Orientierungspunkt für eine genaue Richtung während der Dissektion verwendet werden kann.</li>
		<li>Fassen Sie den Schnitt mit einer Pinzette im M5S-Stil und ziehen oder reißen Sie die Hornhaut aus dem hinteren Teil des Auges. Ziehen Sie in kleinen Schritten, um sicherzustellen, dass die Integrität der Netzhaut intakt bleibt. HINWEIS: Bei diesen Schritten wird der vordere Teil des Auges (Hornhaut, Iris und Linse) vom hinteren Teil der Augenmuschel (neurale und pigmentierte Netzhaut) entfernt.</li>
		<li>Um die Integrität der Netzhautschichten zu erhalten, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das pigmentierte Epithel der Netzhaut aus der Neuralnetzhaut. Die neuronale Netzhaut sollte frei von schwarzen Flecken sein, um die Reinheit der Isolierung so weit wie möglich zu gewährleisten, da die RPE-Schicht in der Regel klebrig und mit der neuronalen Netzhaut verbunden ist.</li>
		<li>Schneiden Sie die präparierte neurale Netzhaut in kleine Stücke, bevor Sie sie in einer Platte sammeln, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Platte zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Die neurale Netzhaut wird in einen T25-Kolben mit 4 ml vollständigem primärem Müllerzell-Wachstumsmedium eingefüllt.</li>
	<li>Zum Schluss wird der Kolben in einen Brutschrank gestellt und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.</li>
</ol>5. Kultivierung von primären Müller-Gliazellen
<ol><li>Bewegen Sie den Kolben 3-5 Tage lang nicht, um das Zellwachstum zu fördern.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium nach dem fünften Tag und danach jeden zweiten Tag, bis die Zellen zu 90 % konfluiert sind.</li>
</ol>6. Passage von primären Müller-Gliazellen
<ol><li>Aspirieren Sie das Müller-Zellkulturmedium, gefolgt von 2 mL Wash in PBS, und aspirieren Sie das PBS heraus. Fügen Sie 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA (1x) hinzu oder genug, um die Platte zu bedecken.</li>
	<li>5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen unter dem Mikroskop von der Platte lösen. Entnehmen Sie dann die Zellsuspension und geben Sie 4 ml vorgewärmtes (37 °C) vollständiges primäres Müller-Zellwachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.2) in das Entnahmeröhrchen.</li>
	<li>7 min bei 300 x g zentrifugieren. Nach dem Aspirieren des Überstands resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL vollständigem primären Müller-Zell-Wachstumsmedium. Da die Zellzahl je nach Anzahl der präparierten Augen variieren kann, ist es besser, die Zellen vor der Aussaat und Inkubation zu zählen. Die empfohlene Aussaatdichte beträgt 3,0 x 106 Zellen in einem T75-Kolben. HINWEIS: Die Zellen können bis zu 4-5 Mal durchlaufen werden. Die konsistentesten Versuchsergebnisse finden sich jedoch nach 1-2 Passagen.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz
HINWEIS: Verwenden Sie das Immunfluoreszenzprotokoll, um die Müller-Zellspezifität zu färben und zu validieren. Hier finden Sie einen kurzen Überblick über das Immunfluoreszenzprotokoll. Dieser Schritt wird nach der ersten Passage12 ausgeführt.
<ol><li>Aussäen Sie die Zellen in einen Zellkulturkammer-Objektträger (30.000 Zellen pro Well für einen 8-Well-Kammer-Objektträger).</li>
	<li>Die isolierten Zellen werden 24-48 h lang in einem vollständigen Müller-Zellkulturmedium (hergestellt in Schritt 1.2) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie den Kammerobjektträger mit 250-300 μl 1x PBS auf jeder Vertiefung, wenn die Zellen zu 80-90 % konfluent sind.</li>
	<li>Befestigen Sie den Objektträger 10 bis 15 Minuten lang in 250-300 μl 4%igem Paraformaldehyd auf jeder Vertiefung, anschließend mit PBS/TX-100 (jeweils 5 Minuten/3x) waschen.</li>
	<li>Blockierenden Puffer für 1 h bei 37 °C zugeben (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Aspirieren Sie die Blockierungslösung und fügen Sie dann die für Müller-Zellen spezifischen Primärantikörper hinzu, um die Reinheit der isolierten Zellen unter Verwendung von Glutaminsynthetase und Vimentin 5,12 zu bestätigen. 3 h bei 37 °C inkubieren (mit einer Antikörperkonzentration von 1:100-1:200 in Blockierungspuffer in einem Volumen von 150-200 μl/Objektträger). Waschen Sie den Objektträger mit PBS/TX-100-Wäschen (jeweils 5 und 10 Minuten). HINWEIS: Diese Antikörper wurden ausgewählt, da sie Kennzeichen für die Identifizierung von Müller-Zellen und die Sicherstellung des Erfolgs und der Reinheit der Müller-Zellkultur sind.</li>
	<li>Den Sekundärantikörper (mit einer Antikörperkonzentration von 1:1000 in Blockierungspuffer in einem 150-200 μl/Objektträger) zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren. Dann dreimal (jeweils 5-10 Minuten) mit PBS/Triton X-100 waschen.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen DAPI-Eindeckmedium auf, um die Kerne zu markieren, bevor Sie den Objektträger mit einem Deckglas abdecken. Vermeiden Sie Luftblasen beim Anbringen des Deckglases.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um den Objektträger zu überprüfen und Bilder aufzunehmen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die Zellen werden mit DAPI bei ex/em 359/461 bei 10-facher Vergrößerung lokalisiert, um Zellen zu lokalisieren. Durch eine höhere Vergrößerung können Zellen eingefangen werden. Andere Wellenlängen hängen von der gewählten Farbe ab. Grüne Farbe (GFP)- ex/em 488/510. Rote Farbe (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären, die für den Inhalt dieses Artikels relevant sind.

Die Isolierung von primärem retinalem pigmentiertem Epithel (RPE) aus Mäusen wurde zuvor von unserem Labor dokumentiert. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Demonstrationsprotokoll für die Isolierung von primären Müller-Zellen. Dieses Verfahren umfasst die Enukleation, Behandlung, Dissektion, Sammlung, Aussaat, Kultur und Charakterisierung von Müller-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden. Es basiert auf einem bereits erfolgreichen Protokoll, das in früheren Publikationen gefunden wurde, und unserem modifizierten Protokoll, das wir in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung verwendet haben1, 2,13. Die Schritte sind zwar einfach, aber eine erfolgreiche Müller-Zellisolierung erfordert die Einhaltung spezifischer Einschränkungen und grundlegender Anforderungen. Nach zahlreichen Versuchen und Irrtümern, dieses Protokoll zu optimieren, wurden mehrere Faktoren identifiziert, die den Erfolg beeinflussen.
Das ideale Alter der Maus, wie es in unseren Experimenten beobachtet wurde, lag zwischen 5 und 11 Tagen, um die isolierten Zellen auf bis zu vier Passagen wachsen zu lassen. Die Kultur wird auch davon beeinflusst, wie viele Augen isoliert und kultiviert sind. Für die einfache Isolierung sind mindestens zwei Augen erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, um wachsen und sich vermehren zu können. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dauer zwischen Enukleation und Plattierung; Daher muss dieser Schritt relativ schnell durchgeführt werden. Es wurde beobachtet, dass sich eine längere Manipulation des Augengewebes nachteilig auf die Fähigkeit der Zellen auswirkt, am Kolben zu haften und sich zu vermehren. Um sicherzustellen, dass die Nähe der isolierten Zellen nahe genug ist, um die Proliferation zu fördern, empfehlen wir die Verwendung eines T25-Kolbens. Sobald der erste Durchgang erfolgt ist, können die Zellen auf einem T75 plattiert werden. Auch sollten die Zellen nach der Isolierung und Aussaat nicht gestört werden, indem der Gewebekulturkolben aus dem Inkubator genommen oder das Medium für mindestens 5 Tage gewechselt wird. Schließlich können Zellen nur etwa viermal passiert werden, bevor sie nicht mehr anhaften. Obwohl dieses Verfahren unkompliziert und einfach durchzuführen ist, weist es einige Einschränkungen auf, darunter das Alter der Mäuse, die begrenzte Anzahl von Zellpassagen usw.
Es gibt nicht viele Protokolle für die Isolierung von Müller-Zellen, aber es gibt einige bemerkenswerte Unterschiede zwischen diesem Protokoll und den verfügbaren Protokollen 5,14. Erstens ist die Zeit zwischen Enukleation und Isolierung deutlich unterschiedlich. Andere Protokolle schlagen eine Dissektion kurz nach der Enukleation vor, typischerweise innerhalb von 10 Minuten. Das derzeitige Protokoll schlägt eine Ruhephase von mindestens 18 Stunden vor, da dies die besten Ergebnisse für die Isolierung in diesem Protokoll lieferte. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen diesem Protokoll und anderen Protokollen ist der Punkt, an dem die Augen mit Enzymen behandelt werden. Bei diesem Protokoll werden die Augen behandelt, bevor eine Dissektion durchgeführt wurde, noch bevor das Bindegewebe und die extraokulare Muskulatur entfernt werden. Während andere Protokolle die Netzhaut vor der Enzymbehandlung vom Auge isolieren. Darüber hinaus ist auch die Enzymrezeptur anders. In diesem Protokoll besteht die Enzymlösung aus Trypsin und Kollagenase Typ IV. In ähnlichen Protokollen werden Papain und DNase für die Gewebeverdauung verwendet. Darüber hinaus ist das Kulturgefäß anders, dieses Protokoll schlägt vor, nach der ersten Passage auf einem T25 und dann auf einem T75 zu kultivieren. Während andere Protokolle Petrischalen oder Multi-Well-Platten verwenden. Schließlich schlägt dieses Protokoll vor, dass der Kolben nicht gestört werden sollte (für 5-7 Tage), um das Zellwachstum zu fördern. Während bei anderen Protokollen der Medienwechsel nach einem Tag durchgeführt wird.

Müller-Zellen (MCs) sind die wichtigsten und am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Netzhautgewebe. Sie sind die Hauptakteure bei der Gewährleistung der strukturellen Integrität und der Stoffwechselfunktionen in der Netzhaut1. Die strategische Struktur der MCs erstreckt sich über die gesamte Netzhautdicke und bietet so Unterstützung für die Netzhaut. Zusätzlich zu ihren gerüstartigen Eigenschaften haben sie metabolische Funktionen für retinale Neuronen und versorgen sie mit Energiesubstraten, darunter Glukose und Laktat. Diese Funktionen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung einer gesunden neuronalen Funktion. Es wurde berichtet, dass beeinträchtigte MCs zu verschiedenen Netzhauterkrankungen beitragen, darunter altersbedingte Makuladegeneration, diabetische Retinopathie und Glaukom 2,3. MCs können endogene zelluläre Quellen für die regenerative Therapie in der Netzhaut sein1. Sie machen auch einen bedeutenden Teil der Netzhaut aus, und es gibt starke Hinweise darauf, dass diese Zellen bei mehreren Spezies stimuliert werden können, um fehlende Neuronen zu ersetzen2. Sie arbeiten vorteilhaft mit Neuronen zusammen, und die konisch verzweigten Endfüße der Müller-Zellen schließen die Blutgefäße dicht aus und verbinden die neuronalen Komponenten der Netzhaut. Um die neuronale Entwicklung und die neuronale Plastizität aufrechtzuerhalten, fungieren Müller-Zellen als weiches Substrat für Neuronen und schützen sie vor mechanischen Traumata3. Darüber hinaus können sich Müller-Zellen unter pathologischen Umständen in neurale Vorläuferzellen oder Stammzellen differenzieren, die die verlorenen Photorezeptoren und Neuronen replizieren oder regenerieren 2,3,4. Müller-Zellen behalten die Eigenschaften retinaler Stammzellen bei, einschließlich unterschiedlicher Potenziale zur Selbsterneuerung und Differenzierung 5,6. Die Müller-Gliazelle hat eine bedeutende retinale Abstammung, die neurotrophe Faktoren produziert, Neurotransmitter aufnimmt und recycelt, Ionen räumlich puffert und die Blut-Netzhaut-Schranke aufrechterhält, um die Netzhaut in Homöostase zu halten 7,8,9. Dies unterstreicht das Potenzial von Müller-Zellen als vielversprechendes Werkzeug in zellbasierten Therapien zur Behandlung von Krankheiten, die mit Netzhautdegeneration in Verbindung stehen. Müller-Zellen sind die primären Gliazellen, die über die Netzhaut verteilt sind und sowohl mit Neuronen als auch mit Blutgefäßen verbunden sind. Sie spielen eine entscheidende schützende Rolle und bieten eine wesentliche strukturelle und metabolische Unterstützung, um die Lebensfähigkeit und Stabilität der Netzhautzellen zu erhalten. Leider gibt es in der Literatur nur sehr wenige Protokolle für die primäre Müller-Zell-Isolierung aus der Netzhaut10,11.
Wir stellen einen verbesserten Ansatz zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von primären Müller-Zellen der Maus vor. Dieses Protokoll wurde in unserer Gruppe verwendet, um Müller-Zellen aus den Wildtyp-Mäusen C57BL/6 und transgenen Mäusen12,13 zu isolieren. Für dieses Protokoll werden Mäuse im Alter zwischen 5 und 11 Tagen ohne Geschlechtspräferenz verwendet. Die Zellen wurden bis zu 4 Mal durchquert; Bei P4 halten sie sich jedoch nicht mehr an den Kolben, und es wird schwierig, eine gesunde Kultur aufzubauen. Die Kultur ist oft mit retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) kontaminiert, daher sollten die Zellen mindestens einmal durchgelassen werden, bevor weitere Experimente an der Zelllinie durchgeführt werden. Die Passage ermöglicht eine weitere Isolierung von Verunreinigungen. Daher bietet das vorgestellte Protokoll eine schnelle und effektive Möglichkeit, Müller-Zellen der Maus zu isolieren, die dann als zuverlässige Plattform zur Erforschung therapeutischer Ziele und zur Bewertung potenzieller Behandlungen für Netzhauterkrankungen verwendet werden können14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

Die primäre Stützzelle der Netzhaut ist die retinale gliale Müllerzelle. Sie bedecken die gesamte Netzhautoberfläche und befinden sich in unmittelbarer Nähe sowohl der retinalen Blutgefäße als auch der retinalen Neuronen. Aufgrund ihres Wachstums erfüllen Müller-Zellen mehrere entscheidende Aufgaben in einer gesunden Netzhaut, darunter die Aufnahme und das Recycling von Neurotransmittern, Retinsäureverbindungen und Ionen (wie Kalium K+). Neben der Regulierung des Blutflusses und der Aufrechterhaltung der Blut-Netzhaut-Schranke regulieren sie auch den Stoffwechsel und die Nährstoffversorgung der Netzhaut. In diesem Manuskript wird ein etabliertes Verfahren zur Isolierung primärer Müller-Zellen der Maus vorgestellt. Um die zugrundeliegenden molekularen Prozesse in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen besser zu verstehen, ist die Müller-Zellisolierung ein hervorragender Ansatz. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Isolierung von Müller-Zellen aus Mäusen. Von der Enukleation bis zur Aussaat dauert der gesamte Prozess etwa einige Stunden. Für 5-7 Tage nach der Aussaat sollte das Medium nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungehindert wachsen können. Als nächstes folgt die Zellcharakterisierung mit Hilfe von Morphologie und eindeutigen Immunfluoreszenzmarkern. Die maximale Anzahl von Durchgängen für Zellen beträgt 3-4 Mal.

Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion von isolierten Müller-Zellen Um die Lebensfähigkeit, Morphologie und charakteristischen Eigenschaften der isolierten Müller-Zellen zu bestätigen, wurden die Zellen unter einem Lichtmikroskop untersucht. Es wurden P0- und P1-Bilder aufgenommen (Abbildung 1A). Um die Kontamination der isolierten Müller-Zellen mit RPE-Zellen zu überprüfen und ihre Reinheit zu bestätigen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) mit Antikörpern durchgeführt, die spezifisch für den RPE-Zellmarker RPE65 sind. Als Positivkontrolle wurden humane retinale pigmentierte Zellen (ARPE -19) verwendet. RPE65-gefärbte RPE-Zellen (rot und blau für die Kernfärbung) sind in Abbildung 1B (unteres Bild) dargestellt. RPE65-spezifische Antikörper färbten die isolierten Müller-Zellen nicht (Abbildung 1B, oberes Bild). Die Tatsache, dass das RPE65 die ARPE-19-Zellen (rot) gefärbt hat und die isolierten Zellen nicht gefärbt hat, deutet darauf hin, dass es sich bei den isolierten Zellen nicht um RPE-Zellen handelt. Das Vorhandensein von Pyruvat und niedriger Glukose in den Medien schafft ungünstige Bedingungen für das Wachstum von RPE-Zellen. Folglich lösen sie sich auch im Falle einer Kontamination der RPE-Zellen schließlich vom Kolben.
Darüber hinaus wurde zur Bestätigung der Identität isolierter Zellen eine Müller-Zell-Immunfluoreszenzfärbung für Müller-Zell-spezifische Marker verwendet, um die erfolgreiche Isolierung von Müller-Zellen zu bestätigen. Das Zytoskelett-Zwischenfilamentprotein namens Vimentin wurde verwendet12,13. Darüber hinaus wurde auch die Glutaminsynthetase (GS) verwendet, die die Reaktion der Kondensation von Glutamat und Ammoniak zu Glutamin katalysiert, als Schlüsselfunktion der retinalen glialen Müller-Zellen.
Insgesamt wurden die isolierten Zellen negativ für RPE65 (rot, Abbildung 1B), positiv für Vimentin (grün, Abbildung 1C) und GS (grün, Abbildung 1D) gefärbt. Die IF-Färbung bestätigt die erfolgreiche Isolierung (Reinheit und Spezifität) der isolierten Müller-Zellen. Abbildung 1E zeigt eine Negativkontrolle für Vimentin (oberes Feld) und GS (unteres Feld), die die Spezifität der Antikörper bestätigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> Abbildung 1: Validierung der Müller-Zellisolierung (Reinheit und Spezifität). (A) Lichtmikroskopisches Bild für die Passagen: Passage Null(P0)und (P1)Morphologie. (B) RPE65-Immunfärbung in Kombination mit DAPI-Kernfärbung. (C) Vimentin-Immunfärbung mit DAPI-Kernfärbung bei hoher Vergrößerung. (D) GS-Immunfärbung bei gleicher hoher Vergrößerung. (E) Negativkontrollen zur Bestätigung der Spezifität der Vimentin- und GS-Antikörperfärbung. Maßstabsleiste = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm bzw. 50 μm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K Aufrufe.  Oakland University. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Serie: Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Forschung

Biotechnik

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biologie

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Entwicklungsbiologie

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurowissenschaften

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus