Dieses Protokoll ermöglicht es dem Forscher, die interessierende Arterie zu sezieren und Gefäßzellen zu isolieren, um eine breite Palette von Funktionstests durchzuführen. Forscher können verschiedene Gefäßbetten und Zelltypen untersuchen, um das Wissen über die Gefäßzellbiologie und den Mechanismus der vaskulären Dysfunktion zu erweitern. Diese Methode eignet sich am besten für Forscher, die die grundlegende vaskuläre Zellbiologie sowie die Dysfunktion vaskulärer Zellen in Tiermodellen von Krankheiten untersuchen.
Besondere Sorgfalt sollte auf die Optimierung des Verdauungsprotokolls verwendet werden, insbesondere wenn sich die interessierenden Gefäßbetten von den hier vorgestellten unterscheiden. Um zu beginnen, sichern Sie die Maus mit Dissektionsstiften und besprühen Sie die ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut direkt über den Genitalien anzuheben, und machen Sie einen kleinen Schnitt von etwa zwei Millimetern in der Haut.
Führen Sie die Spitze der Schere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen vier bis fünf Zentimeter langen Mittellinienschnitt, der mit dem ersten Schnitt beginnt und kranial zur Basis des Brustbeins seziert. Machen Sie einen Einschnitt von einem Zentimeter, der seitlich von der Mittellinie unmittelbar unter der Vorderbein reicht. Machen Sie einen diagonalen Einschnitt von einem Zentimeter zwischen der Hinterbein und den Genitalien.
Machen Sie kleine Schnitte entlang der Mittellinien-Hautschnitte, um das zugehörige Bindegewebe abzuziehen und das subkutane Fettdepot freizulegen. Identifizieren Sie das C-förmige subkutane Fettgewebe und die Arterie oder Vene, die senkrecht zur Bauchhöhle verläuft. Beginnen Sie von der Unterseite der C-Form in der Nähe der Genitalien und greifen Sie sanft das Fettgewebe, um das Bindegewebe freizulegen.
Machen Sie kleine Schnitte im Bindegewebe, um das Fett von der Haut zu trennen, und vermeiden Sie, das freiliegende Gefäßsystem zu stören. Das Bindegewebe wird weiter seziert, bis das subkutane Fettgewebe intakt entfernt werden kann. Trennen Sie die freiliegende Arterie vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe.
Lagern Sie das isolierte subkutane Fett im HEPES-Puffer auf Eis. Wiederholen Sie die Dissektion für das verbleibende hintere subkutane Fettdepot. Um das mesenteriale Fettdepot zu isolieren, verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die dünne Peritonealhöhlenwand über der Harnblase anzuheben, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer geraden Schere.
Heben Sie langsam die Peritonealhöhlenwand an und führen Sie die gerade Irisschere in die Inzisionsstelle ein. Machen Sie einen Schnitt von vier bis fünf Zentimetern von der Harnblase bis zum Brustbein. Machen Sie dann zwei horizontale Einschnitte von einem Zentimeter mit der geraden Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie bis unmittelbar über die Hinterbein und unter die Vordergliedmaße erstreckt.
Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen und die Peritonealeingeweide freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette Nummer fünf, um den Darm aus der Viszeralhöhle zu heben, um das mesenteriale Fett freizulegen. Verwenden Sie die gebogene Schere und die Zange Nummer fünf, um das Fett entlang des Dickdarms zu trennen, beginnend vom Blinddarm bis zum Abstieg des Dickdarms aus dem Blickfeld.
Dann trennen Sie das Fett entlang des Dünndarms zur Bauchspeicheldrüse. Entfernen Sie einen kleinen Teil der Bauchspeicheldrüse, um das mesenteriale Fett vollständig zu isolieren. Lagern Sie das isolierte mesenteriale Fett im HEPES-Puffer auf Eis.
Um die Arterien zu isolieren, übertragen Sie zuerst das Fettgewebe in eine Sezierschale, die 10 Milliliter kalten HEPES-Puffer enthält. Positionieren Sie unter einem Stereomikroskop das subkutane Fettgewebe, um das Arterienvenenpaar freizulegen. Positionieren Sie das viszerale Fettgewebe, um die Blumenkohlform und das jeweilige Arterienvenenpaar freizulegen.
Verwenden Sie die Zange Nummer 55, um das parenchymale Fett vorsichtig aus der Arterie zu entfernen. Entfernen Sie kleine Fettstücke auf einmal, ohne das interessierende Gefäßsystem zu beschädigen. Fahren Sie fort, bis die Arterien vollständig frei von parenchymalem Fettgewebe sind.
Verwenden Sie die Nummer fünf Pinzetten, um die gereinigten Arterien in einen neuen Schlauch mit frischem HEPES-Puffer zu übertragen, und halten Sie sie auf Eis, bis sie für die Verdauung bereit sind. Fügen Sie zuerst jeweils ein Milligramm Dispase und Elastase zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationslösung, Wirbel hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, bis sie vollständig aufgelöst sind.
Verwenden Sie die Nummer fünf Pinzetten, um die gereinigten Arterien in die jeweiligen Probenröhrchen zu übertragen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit sanftem Rühren durch Inversion alle 10 bis 15 Minuten. In der Zwischenzeit fügen Sie ein Milligramm Kollagenase Typ eins pro Probe zu neuen Röhrchen hinzu.
Lassen Sie nach der Inkubation die Arterien am Boden des Röhrchens absetzen und übertragen Sie 500 Mikroliter des Puffers von oben in die Kollagenase-haltigen Röhrchen. Vortex und geben Sie diese Lösung in die jeweiligen Probenröhrchen zurück. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.
Stellen Sie sicher, dass sich die Arterien beim Schütteln des Probenröhrchens in Stücke trennen. Mit einer Glaspipette das verdaute Gewebe 10 bis 15 Mal kräftig trituieren, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren. Führen Sie die aufgeschlossenen Proben durch ein 70-Mikron-Zellsieb oder ein Durchflusszytometrie-Röhrchensieb, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 5% BSA für 30 Minuten. Fügen Sie einen Mikroliter Zelllebensfähigkeitsfärbung hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 Minuten.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS mit 1% BSA. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die an CD31 und CD45 konjugiert sind, und inkubieren Sie 15 Minuten lang auf einer Wippe im Kühlschrank. Waschen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter PBS mit 1% BSA direkt in die Zellsuspension geben.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern 1% Formaldehyd mit 0,1% BSA. Die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie für die Durchflusszytometrie bereit sind. Zellpräparate aus verdauten subkutanen Fettarterien wurden verwendet, um die Endothelzellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.
CD31-positive CD45-negative Zellen wurden als Endothelzellen identifiziert. Die Zelllebensfähigkeitsfärbung ermöglichte die Identifizierung nur der lebensfähigen Zellen, die das Isolierungs- und Verdauungsprotokoll vor der Fixierung überlebten. Um die Unterschiede in der Membranproteinexpression und den Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepotgefäßen zu identifizieren, wurden die isolierten Zellen auf Fettsäuretranslokase CD36 untersucht.
CD36-positive Endothelzellen wurden im subkutanen und mesenterialen Fettgewebe identifiziert. Die Quantifizierung der CD36-Expression und der subkutanen und mesenterialen Endothelzellen zeigte, dass sowohl der Prozentsatz der Endothelzellen, die CD36 exprimieren, als auch die Intensität der CD36-Expression in subkutanen Endothelzellen größer waren. Es ist wichtig, die Arterien sorgfältig zu sezieren, zu identifizieren und zu reinigen.
Am wichtigsten ist, dass das Verdauungsprotokoll eine ausreichende Ausbeute an lebensfähigen Zellen für nachgelagerte Anwendungen liefert. Nach diesem Verfahren kann die isolierte Zellpopulation für Anwendungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Elektrophysiologie, molekulares Profiling und Generierung einer primären Zelllinie für das Arzneimittelscreening in vitro.
