سيسمح هذا البروتوكول للباحث بتشريح الشريان محل الاهتمام وعزل الخلايا الوعائية لإجراء مجموعة واسعة من الاختبارات الوظيفية. يمكن للباحث التحقيق في أسرة الأوعية الدموية المختلفة ونوع الخلية لتوسيع المعرفة ببيولوجيا الخلية الوعائية وآلية خلل الأوعية الدموية. هذه الطريقة هي الأكثر قابلية للتطبيق على الباحثين الذين يحققون في بيولوجيا الخلايا الوعائية الأساسية ، وكذلك خلل الخلايا الوعائية في النماذج الحيوانية للأمراض.
يجب توخي الحذر بشكل خاص لتحسين بروتوكول الهضم ، خاصة عندما تختلف أسرة الأوعية الدموية ذات الأهمية عن تلك المعروضة هنا. للبدء ، قم بتأمين الماوس باستخدام دبابيس التشريح ورش السطح البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم الملقط لرفع الجلد مباشرة فوق الأعضاء التناسلية ، وقم بعمل شق صغير يبلغ حوالي مليمترين في الجلد.
أدخل طرف المقص في موقع الشق ، وقم بعمل شق خط الوسط بطول أربعة إلى خمسة سنتيمترات يبدأ من الشق الأولي ، وتشريح الجمجمة إلى قاعدة القص. قم بعمل شق بمقدار سنتيمتر واحد يمتد أفقيا من خط الوسط أسفل الطرف الأمامي مباشرة. قم بعمل شق قطري سنتيمتر واحد بين الطرف الخلفي والأعضاء التناسلية.
قم بعمل جروح صغيرة على طول شقوق الجلد في خط الوسط لتقشير النسيج الضام المرتبط بها ، وفضح مستودع الدهون تحت الجلد. تحديد الأنسجة الدهنية تحت الجلد على شكل حرف C والشريان أو الوريد الذي يمتد عموديا على تجويف البطن. ابدأ من أسفل شكل C بالقرب من الأعضاء التناسلية ، وأمسك بلطف الأنسجة الدهنية لفضح الأنسجة الضامة.
قم بإجراء جروح صغيرة في النسيج الضام لفصل الدهون عن الجلد ، وتجنب إزعاج الأوعية الدموية المكشوفة. استمر في تشريح النسيج الضام حتى يمكن إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد سليمة. افصل الشريان المكشوف بعناية عن النسيج الضام المحيط.
تخزين الدهون المعزولة تحت الجلد في المخزن المؤقت HEPES على الجليد. كرر تشريح مستودع الدهون الخلفي المتبقي تحت الجلد. لعزل مستودع الدهون المساريقي ، استخدم ملقط Graefe لرفع جدار التجويف البريتوني الرقيق فوق المثانة البولية ، وقم بعمل شق صغير باستخدام مقص مستقيم.
ارفع جدار التجويف البريتوني ببطء وأدخل مقص القزحية المستقيم في موقع الشق. قم بعمل شق من أربعة إلى خمسة سنتيمترات من المثانة البولية إلى القص. ثم قم بعمل شقين أفقيين بسنتيمتر واحد باستخدام مقص القزحية المستقيم الممتد أفقيا من خط الوسط إلى أعلى الطرف الخلفي مباشرة وأسفل الطرف الأمامي.
استخدم ملقط Graefe لتقشير عضلات البطن مرة أخرى وفضح الأحشاء البريتونية. استخدم زوجا من الملقط رقم خمسة لرفع الأمعاء من التجويف الحشوي للكشف عن الدهون المساريقية. استخدم المقص المنحني والملقط رقم خمسة لفصل الدهون على طول القولون ، بدءا من الأعور إلى حيث ينحدر القولون عن الأنظار.
ثم ، افصل الدهون على طول الأمعاء الدقيقة إلى البنكرياس. إزالة جزء صغير من البنكرياس لعزل الدهون المساريقي تماما. تخزين الدهون المساريقية المعزولة في مخزن HEPES العازل على الجليد.
لعزل الشرايين ، قم أولا بنقل الأنسجة الدهنية إلى طبق تشريح يحتوي على 10 ملليلتر من مخزن HEPES البارد. تحت المجهر الاستريو ، ضع الأنسجة الدهنية تحت الجلد لفضح زوج وريد الشريان. ضع الأنسجة الدهنية الحشوية لكشف شكل القرنبيط وزوج وريد الشريان المعني.
استخدم الملقط رقم 55 لإزالة الدهون المتنية بعناية من الشريان. إزالة قطع صغيرة من الدهون في وقت واحد دون الإضرار الأوعية الدموية ذات الاهتمام. استمر حتى تصبح الشرايين خالية تماما من الأنسجة الدهنية المتني.
استخدم الملقط رقم خمسة لنقل الشرايين التي تم تنظيفها إلى أنبوب جديد مع مخزن مؤقت HEPES طازج ، واحتفظ به على الثلج حتى يصبح جاهزا للهضم. أولا ، أضف ملليغرام واحد لكل من dispase و elastase إلى أنبوب طرد مركزي صغير بملليلترين. أضف ملليلترين من محلول التفكك ، الدوامة ، واحتضن عند 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما.
استخدم الملقط رقم خمسة لنقل الشرايين التي تم تنظيفها إلى أنابيب العينة المعنية. احتضن الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع إثارة لطيفة عن طريق الانعكاس كل 10 إلى 15 دقيقة. في غضون ذلك، أضف ملليغرام واحد من الكولاجيناز من النوع الأول لكل عينة إلى أنابيب جديدة.
بعد الحضانة ، اسمح للشرايين بالاستقرار في أسفل الأنبوب ونقل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت من الأعلى إلى الأنابيب التي تحتوي على الكولاجيناز. دوامة وإعادة هذا الحل إلى أنابيب العينة المعنية. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
تأكد من انفصال الشرايين إلى قطع عند هز أنبوب العينة. باستخدام ماصة زجاجية ، قم بمضاعفة الأنسجة المهضومة بقوة من 10 إلى 15 مرة لفصل الخلايا ميكانيكيا. مرر العينات المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون أو مصفاة أنبوب قياس التدفق الخلوي للحصول على معلقات خلية واحدة.
الطرد المركزي تعليق خلية واحدة وإزالة supernatant. أعد تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من PBS مع 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة. أضف ميكرولتر واحد من بقعة بقاء الخلية واحتضنها في الظلام لمدة 30 دقيقة.
الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من PBS مع 1٪ BSA. أضف الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع CD31 و CD45 واحتضنها على الروك في الثلاجة لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS مع 1٪ BSA مباشرة إلى تعليق الخلية.
الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الفورمالديهايد 1٪ مع 0.1٪ BSA. قم بتغطية الأنابيب بورق الألومنيوم وتخزينها في الثلاجة حتى تصبح جاهزة لقياس التدفق الخلوي. تم استخدام مستحضرات الخلايا التي تم الحصول عليها من الشرايين الدهنية تحت الجلد المهضومة لتحديد مجموعات الخلايا البطانية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
تم تحديد الخلايا السلبية CD31 CD45 الإيجابية كخلايا بطانية. سمحت وصمة بقاء الخلية بتحديد فقط تلك الخلايا القابلة للحياة التي نجت من بروتوكول العزل والهضم قبل التثبيت. لتحديد الاختلافات في التعبير عن البروتين الغشائي والخلايا البطانية من الأوعية الدموية المتميزة في مستودع الدهون ، تم فحص الخلايا المعزولة بحثا عن الحمض الدهني الشفاف CD36.
تم تحديد الخلايا البطانية الإيجابية CD36 في الدهون تحت الجلد والمساريقي. كشف القياس الكمي لتعبير CD36 والخلايا البطانية تحت الجلد والمساريقي أن كلا من النسبة المئوية للخلايا البطانية التي تعبر عن CD36 ، وشدة تعبير CD36 كانت أكبر في الخلايا البطانية تحت الجلد. من الأهمية بمكان تشريح الشرايين وتحديدها وتنظيفها بعناية.
الأهم من ذلك ، يجب أن ينتج بروتوكول الهضم عائدا كافيا من الخلايا القابلة للحياة للتطبيقات النهائية. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام مجموعة الخلايا المعزولة للتطبيقات بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ، الفيزيولوجيا الكهربية ، والتنميط الجزيئي ، وتوليد خط الخلية الأولية لفحص الأدوية في المختبر.
