Dieses Protokoll beschreibt sequentiell die Schritte, die an der Induktion einer Augenoberflächenentzündung und der Sammlung der damit verbundenen betroffenen Organe beteiligt sind, die an der Meibom-Drüsendysfunktion beteiligt sind. Dieses neue Modell der MGD ermöglicht die Untersuchung des angeborenen Immunaspekts der Krankheit, insbesondere der Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen, die die Meibom-Drüse einschließen. Die im Protokoll gezeigte Technik kann erweitert werden, um topische therapeutische Interventionen in einem präklinischen Stadium einzuführen.
Darüber hinaus spiegelt die Entnahme von Augenexsudaten und Organen die Wirksamkeit der Behandlung wider. Um eine intraperitoneale Injektion der Immunogenlösung durchzuführen, halten Sie die sieben bis neun Wochen alte C57 schwarze sechs nicht betäubte weibliche Maus sanft am Schwanz, während Sie das Käfiggitter greifen. Halten Sie dann die Haut des Rückens und der Nackenregion fest zwischen Daumen und Zeigefinger und fixieren Sie den Schwanz und die unteren Gliedmaßen zwischen dem Ring und dem kleinen Finger gegen die Handfläche.
Halten Sie die Maus mit dem Kopf nach unten fixiert, injizieren Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Immunogenlösung in den rechten oder linken Quadranten der unteren Bauchhöhle. Um eine Augenoberflächenherausforderung nach der Immunisierung durchzuführen, tragen Sie fünf Mikroliter Ovalbumin oder Eizellen oder Kochsalzlösung pro Auge einer anästhesierten Maus auf und warten Sie fünf Minuten, bis der Tropfen vom Auge absorbiert wird. Als nächstes sammeln Sie die Augenexsudate, indem Sie unmittelbar nach der Herausforderung 50 Mikroliter sterile Kochsalzlösung auf das Auge auftragen.
Für die Entfernung von Augenoberflächengewebe legen Sie die Maus auf eine ebene Oberfläche und desinfizieren Sie den Augenorbitalbereich um das Auge mit einem 70% igen Ethanoltupfer. Um einen Schnitt um das Auge zu bilden, machen Sie einen Schnitt zwischen dem Ohr und dem retroorbitalen Sinus und entlang der Oberfläche über dem Plattenepithelknochen vertikal, wobei der Schnitt horizontal unter dem unteren Augenlid entlang des Oberkieferknochens und oberhalb des oberen Augenlids entlang des Stirnbeins verlängert wird. Halten Sie das sezierte Gewebe vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette um das Auge herum und ziehen Sie das Gewebe und den Augapfel heraus.
Legen Sie die herausgeschnittenen Organe in steriles PBS. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell unter dem Stereomikroskop das überschüssige Gesichtsmuskelgewebe um die herausgeschnittenen oberen Augenlider ab. Um die Bindehaut zu sammeln, legen Sie das obere Augenlid auf eine trockene Petrischale.
Anschließend mit einer feinen Pinzette und einem Skalpell die weißliche Schleimschicht sanft aus der Innenseite des Augenlids schälen. Um die Hornhaut zu sezieren, legen Sie die Augenkugel auf eine neue trockene Petrischale auf Trockeneis. Nach drei Minuten stellen Sie die Schale in einer stabilen Position auf die Bankoberfläche.
Verwenden Sie eine feine, scharfe Schere, um einen kleinen Schnitt am Rand der Hornhaut neben dem Limbus zu machen. Setzen Sie den Schnitt mit dem Skalpell um den Augenglobus fort und trennen Sie die Sklera von der Hornhaut. Entfernen Sie dann die Iris- und Linsenreste von der Rückseite der Hornhaut, indem Sie großzügig mit Kochsalzlösung spülen.
Um die Meibom-Drüse und ihre Öffnungen zu beurteilen, platzieren Sie die ausgeschnittenen Augenlider in einer aufrechten Position unter dem Stereomikroskop. Nehmen Sie dann entsprechend der Belichtungszeit der Kamera und den ISO-Einstellungen Bilder unter Weißlicht-Epi-Beleuchtung auf. Um den Meibom-Drüsenbereich zu beurteilen, platzieren Sie die ausgeschnittenen Augenlider in einer horizontalen Position und schalten Sie die Hintergrundbeleuchtung des Stereomikroskops ein, das mit einer Infrarotkamera ausgestattet ist.
Nehmen Sie Bilder auf, indem Sie die Belichtungszeit entsprechend dem ISO-Wert der Kamera anpassen. Kochsalzlösung verabreichte Mäuse zeigten gesunde Augenoberflächen mit weit geöffneten Augen. Im Vergleich dazu induziert die Anwendung von Eizellen eine schwere Entzündung der Augenoberfläche, die enge Öffnung der Augen und Anzeichen einer Chemose.
Die ausgeschnittenen Augenlider zeigten große Okklusionen, die die Öffnungen der Meibom-Drüse und des Ödems verstopften, im Gegensatz zu den gesunden Augenlidern, die kleine Pfropfen der Drüse zeigten, die das Augenlid auskleideten. Eine weitere Untersuchung der Infrarotdurchleuchtung der Drüse zeigt das racemische Aussehen der Acini der Meibom-Drüse. Die Augenlider von Kochsalz-herausgeforderten Mäusen zeigten die runden Acini.
Im Vergleich dazu induzierten Eizellenanwendungen die Zerstörung und den Verlust einiger Drüsen mit der allergischen Augenerkrankung oder AED. Die histologische Analyse der Augenlider zeigte erweiterte Meibom-Drüsen im Vergleich zu Mäusen, denen nur Kochsalzlösung verabreicht wurde. Die Inkubation des Augapfels auf Trockeneis ermöglichte den Schnitt an der Hornhaut neben dem Limbus und die Trennung der Hornhaut von der Sklera.
Diese Studie erleichterte die Entnahme der Hornhaut. Darüber hinaus verursachte die Eizellenverabreichung der Bindehaut eine schwere Entzündung mit einem hyperämischen Aussehen. Erhöhte Konzentrationen des Chemokins CXCL-1 erleichtern die Extravasation von Neutrophilen, Phagozytose und Degranulation, und Interleukin-6, das die akute Phasenantwort und die Neutrophileninfiltration vermittelt, wurden in den Überständen von AED-Mäusen beobachtet.
Auf der anderen Seite zeigte die Konzentration von Interleukin-10 keine signifikanten Veränderungen sowohl bei naiven als auch bei AED-Mäusen. Dieses neue Modell ermöglicht die Entwicklung und Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten, die auf die angeborenen Immunwege abzielen, und ist eine große Hilfe beim Data Mining der Art und Weise der Verabreichung von entzündungshemmenden Wirkstoffen. Nach entsprechender Organentnahme sind Hochmultiplex-Methoden wie Einzelzellsequenzierung und bildgebende Massenzytometrie mit diesem Protokoll kompatibel.
