Es hat sich gezeigt, dass die globale Chromatindynamik ein wichtiger Mediator für mehrere Krankheitszustände wie Krebs und Altern ist. Unser Protokoll bietet ein physiologisch relevantes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen. Die Standardlaboranalyse von Histon-posttranslationalen Modifikationen oder PTMS beschränkt sich in der Regel auf die Untersuchung eines einzelnen PTM gleichzeitig unter Verwendung von Antikörper-basierten Assays.
Die flüssigkeitschromatographische Massenspektrometrie-Analyse von Histon-PTMS ermöglicht es uns, die Häufigkeit von Hunderten von PTMS in einem einzigen Experiment zu messen. Das Verfahren wird von Stephanie Stransky, Ronald Cutler und Julie Kim, einer Postdoktorandin, Doktorandin und Forschungstechnikerin aus dem Labor, demonstriert. Erstens, mit Standard-Wachstumsmedien, züchten Sie die Zellen als Monolayer, bis sie zu 80% konfluent sind.
Dann waschen Sie die Zellen mit HBSS. Fügen Sie fünf Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, verdünnt in HBSS. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu überprüfen. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischen Wachstumsmedien. Fügen Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedien hinzu, um eine extrem niedrige 24-Well-Rundbodenplatte mit jeweils mehreren Mikrovertiefungen auszugleichen.
Dann zentrifugieren Sie die Platten bei 3000 x g, um Luftblasen von der Oberfläche der Platte zu entfernen. Übertragen Sie nun die zuvor hergestellte Zellsuspension für drei Minuten bei 120 x g auf die 24-Well-Platte und die Zentrifuge. Überprüfen Sie die Zellen in der 24-Well-Platte und inkubieren Sie dann die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden für die Sphäroidbildung.
Um den Bioreaktor auszugleichen, fügen Sie 25 Milliliter steriles Wasser in die Feuchtigkeitskammer und neun Milliliter Wachstumsmedien in die Zellkammer hinzu. Inkubieren Sie den Bioreaktor in einem rotierenden Clinostat-Inkubator für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Lösen Sie die Sphäroide von der extrem niedrig angebrachten 24-Well-Platte, indem Sie sie vorsichtig mit einem Milliliter breiten Bohrungsspitzen pipettieren und in eine Gewebekulturschale geben.
Um Sphäroide ausreichend zu formen, überprüfen Sie die Qualität der Sphäroide unter einem Mikroskop. Gute Qualität Sphäroide haben eine gleichmäßige Größe, Kompaktheit und Rundheit. Füllen Sie den ausgeglichenen Bioreaktor mit fünf Millilitern frischem Wachstumsmedium und übertragen Sie die Sphäroide in ihn.
Dann füllen Sie den Bioreaktor vollständig mit frischen Wachstumsmedien und legen Sie den Bioreaktor bei 10 bis 11 U / min in den Clinostat-Inkubator. Tauschen Sie alle zwei bis drei Tage Wachstumsmedien aus, indem Sie 10 Milliliter alte Medien durch frische Medien ersetzen. Wenn diese Sphäroide an Größe und Anzahl zunehmen, erhöhen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Inkubators.
Nachdem Sie das Sphäroidpellet erhalten haben, fügen Sie dem Pellet fünf Volumina kalte 0,2 molare Schwefelsäure hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um das Pellet zu stören und Histone freizusetzen. Sobald der Überstand nach der Zentrifugation erhalten ist, fügen Sie kalte konzentrierte Trichloressigsäure hinzu, so dass die Endkonzentration 25 bis 30 Volumenprozent beträgt. Und mischen Sie es, indem Sie das Rohr ein paar Mal umkehren und zentrifugieren, wie im Manuskript beschrieben.
Nachdem Sie den Überstand mit einer Glasweidepipette entsorgt haben, waschen Sie das Pellet und die Wände des Rohres mit etwa 500 Mikrolitern kaltem Aceton und 0,1% Salzsäure und zentrifugieren Sie dann bei 3.400 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Röhre um, um den Überstand zu verwerfen. Mit einer Glasweidepipette fügen Sie 500 Mikroliter 100% kaltes Aceton hinzu, um das Pellet und die Zentrifuge zu waschen, wie zuvor gezeigt.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, entfernen Sie das Aceton vollständig durch vorsichtiges Pipettieren und lassen Sie die Probe mit einem geöffneten Deckel etwa 20 Minuten trocknen. Resuspendiert das Pellet in 20 Mikrolitern von 15 bis 20% Acetonitril in einem 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat von pH 8. Drehen Sie nach dem Vortexen die Aufhängung bei 1000 x g für 30 Sekunden herunter.
Bei acht oder mehr Proben ist jede resuspendierte Probe auf eine 96-Well-Platte zu überführen. Dann fügen Sie in einer Haube zwei Mikroliter Propionanhydrid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren. Fügen Sie schnell 10 Mikroliter Ammoniumhydroxid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren.
Mischen Sie HLB-Harz auf einer magnetischen Rührplatte. Dann fügen Sie 70 Mikroliter der HLB-Suspension zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Filterplatte auf einer 96-Well-Auffangplatte hinzu. Nachdem Sie den Durchfluss entsorgt haben, waschen Sie das Harz mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure.
Nachdem Sie jede Probe in 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure resuspendiert haben, laden Sie jede Probe in jede Vertiefung und verhindern Sie das Spritzen mit einem Vakuum. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, waschen Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure und legen Sie die Filterplatte auf eine neue Auffangplatte. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure zu jeder Vertiefung hinzu und verhindern Sie das Spritzen mit Vakuum.
Sammeln Sie den Durchfluss durch und trocknen Sie ihn in einem Geschwindigkeitsvakuum. Laden Sie die getrocknete Entnahmeplatte in die HPLC und führen Sie die LC/MS/MS-Methode wie im Manuskript beschrieben aus. In dieser Studie wurde die relative Häufigkeit häufiger posttranslationaler Histonmodifikationen in C3A-Hepatozyten beobachtet, die als dreidimensionale Sphäroide gezüchtet wurden.
Posttranslationale Modifikationen konnten auch an einem einzelnen Rest in Peptiden beobachtet werden, die aus Histonproteinen erzeugt wurden. Die Behandlung der Sphäroide mit Natriumbutyrat erhöhte die relative Häufigkeit der Histonacetylierung, während die mit Natriumsuccinat die Histonrestprägnylierung verstärkte. Die Methode zeigte auch das Verteilungsmuster der Histonacetylierung nach der Behandlung mit Natriumbutyrat und das der Histonuccinylierung nach der Behandlung mit Natriumsuccinat.
Das Ergebnis zeigte auch gemeinsame Muster verschiedener Histonmodifikationen. Natriumbutyrat-Behandlungen verstärkten signifikant die Acetylierung des Lysinrests 14 auf einem Peptid, das aus dem Histonprotein H3 erzeugt wurde, nur dann, wenn sein neunter Lysinrest zwei Methylgruppen, aber nicht eine oder drei Methylgruppen aufwies. Die relativen Häufigkeiten einzelner Modifikationen und verschiedene Kombinationen posttranslationaler Modifikationen im H3-abgeleiteten Peptid wurden ebenfalls berechnet.
Kombinatorische Muster posttranslationaler Modifikationen nach der Behandlung mit Natriumbutyrat wurden auch in einem Peptid beobachtet, das aus dem Histonprotein H4 erzeugt wurde. Auch hier führte die Behandlung mit Natriumbutyrat zu einem signifikanten Anstieg der Acetylierung. Kritische Aufmerksamkeit sollte darauf gelegt werden, die Sphäroide so wenig wie möglich auf der Bank zu halten und in einem Entsalzungsschritt, um ein Verschütten der Probe zu vermeiden. Dieser Workflow kann verwendet werden, um Chromatin in festem Gewebe unter Verwendung eines physiologischeren Modells als schnell replizierender flacher Zellkulturen zu untersuchen.
