Dieses Protokoll wird für die Forscher nützlich sein, die Methoden für die AAV-Produktion und -Reinigung unter Verwendung des Baculovirus-Insekten-Zellkultursystems entwickeln möchten. Die AAV-Produktion mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem ist eine kostengünstige Methode, die einfach zu skalieren ist und mit der aktuellen guten Herstellungspraxis kompatibel ist. Einige Teile des Protokolls werden von Alan Heizer, einem Forschungsassistenten meines Labors, demonstriert.
Beginnen Sie mit dem Auftauen einer Durchstechflasche mit Sf9-Zellen und säen Sie sie sofort in 15 Milliliter Insektenzellkulturmedium. Züchten Sie Sf9-Zellen in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 125 U / min und 28 Grad Celsius in Rundkolben mit einer lose angebrachten Kappe für den Luftaustausch. Vermehren Sie die Zellen in einem Ein-Liter-Kolben mit 200 Millilitern Medium, um genügend Zellen für die TIPS-Zellproduktion zu erhalten.
50 Milliliter Sf9-Zellen mit 2 mal 10 zu den 6. Leistungszellen pro Milliliter in zwei Kolben geben. Infizieren Sie einen Kolben Sf9-Zellen mit 0,5 Millilitern Baculovirus-AAV2-GFP und den anderen Zellkolben mit 0,5 Millilitern Baculovirus-AAV2-rep-cap. Drei Tage später ernten Sie ein kleines Aliquot baculovirus-infizierter Sf9-Zellen, auch bekannt als TIPS-Zellen.
Färben Sie 2 mal 10 bis zur 5. Potenz sowohl von nicht infizierten als auch von Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen mit 0,5 Mikrogramm Maus-Anti-Baculovirus-gp64-Antikörper, der einen fluoreszierenden Farbstoff in 100 Mikrolitern Blockierungspuffer enthält, für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, um den Antikörper zu entfernen, suspendieren Sie die gefärbten Zellen in 300 Mikrolitern PBS, die 0,5 Rinderserumalbumin enthalten. Analysieren Sie die Baculovirus gp64-Expression auf Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie.
Wenn die Zellen 80 bis 90% lebensfähig sind, mit einer Zunahme des Durchmessers, ernten Sie die Zellen und kryminieren Sie 1 mal 10 bis zur 7. Potenzzelle in einem Milliliter Insektenkulturmedium, ersetzt mit 10% fötalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid in einem langsam gefrierenden Behälter bei minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Tag das Röhrchen mit TIPS-Zellen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank geben. Kultivieren und züchten Sie naive Sf9-Zellen mit 2 mal 10 bis zur 6. Leistungszelle pro Milliliter bei 28 Grad Celsius in mehreren Zwei-Liter-Kolben mit 400 Millilitern Insektenzellkulturmedium in einem Shaker-Inkubator, der für die Adeno-assoziierte Virus- oder AAV-Produktion benötigt wird.
Nach drei bis vier Tagen wird die Zelldichte auf bis zu 5 bis 6 mal 10 bis 6. Leistungszellen pro Milliliter erhöht. Für die AAV-Produktion in Kolben in einem Orbital-Shaker-Inkubator verwenden Sie eine Pipette oder eine Peristaltikpumpe, um 400 Milliliter Sf9-Kultur bei 2 mal 10 bis 6. Leistungszellen pro Milliliter aseptisch in einen Zweiliterkolben zu säen. Stellen Sie den Orbital-Shaker bei 125 U / min und 28 Grad Celsius auf.
Tauen Sie eine Durchstechflasche mit jeder Baculovirus-AAV-GFP- und Baculovirus-AAV-Rep-Cap-TIPS-Zelle auf. Verdünnen Sie die Zellen mit 20 Millilitern Insektenkulturmedium und führen Sie eine Lebensfähigkeitszählung der Zellen mit Trypanblau durch. Impfen Sie beide TIPS-Zellen in einem Verhältnis von 1 zu 10.000 relativ zu den naiven Sf9-Zellen, die in einem Schüttelkolben oder Bioreaktor kultiviert wurden.
Am zweiten Tag ernten Sie einen Milliliter Sf9-Kultur aseptisch und färben Sie ihn mit dem trypanblauen Farbstoff, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie zu analysieren. Wiederholen Sie am dritten Tag die am zweiten Tag ausgeführten Schritte und überprüfen Sie den Status der Baculovirus-Infektion nach dem Färben der Sf9-Zellen. Wiederholen Sie am fünften Tag die am zweiten Tag ausgeführten Schritte und ernten Sie dann das Kulturmedium und die Zellen, wenn die Lebensfähigkeit von Sf9 auf etwa 50% gesunken ist Sammeln Sie den Überstand und das Zellpellet nach dem Spinnen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Sobald das AAV-Produzentenzellpellet aufgetaut ist, fügen Sie ihm Zelllysepuffer hinzu und mischen Sie kräftig. Inkubieren Sie das wieder suspendierte Pellet für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur, um die AAV-Partikel freizusetzen. Nach der Zentrifugation das Zelllysat in einen neuen Behälter überführen.
Mischen Sie das Zelllysat und den Zellkulturüberstand nach dem Auftauen. Fügen Sie dem Zelllysat 20 Einheiten pro Milliliter-Nuklease und 10-millimolares Magnesiumchlorid hinzu, um die DNA und RNA zu verdauen, und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie das Lysat durch ein 0,8 Mikrometer und 0,2 Mikrometer Polyethersulfon Dual-Filtrationssystem mit einer Pumpe.
Lagern Sie das geklärte Zelllysat über Nacht bei vier Grad Celsius oder reinigen Sie das AAV sofort. Montieren Sie eine 10-Milliliter-AVB-Sepharose-Säule auf der Chromatographiemaschine und führen Sie die Rohrleitung in die AAV-Probe, den Waschpuffer und den Elutionspuffer ein. Führen Sie Röhrchen in die Fraktionssammlerschlitze der Chromatographiemaschine ein, um die Fraktionen der Säulendurchlauflösung, des Waschpuffers und des Elutionspuffers, die die AAV-Partikel enthalten, zu sammeln.
Setzen Sie die AVB Sepharose-Säule mit fünf Säulenvolumina PBS bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute aus. Laden Sie das gefilterte Zelllysat enthaltende AAV-Partikel mit hilfe der mit einer Probenpumpe ausgestatteten Chromatographiemaschine auf die AVB Sepharose-Affinitätssäule. Führen Sie die Probe mit einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute aus.
Führen Sie PBS mit einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute durch die Säule, bis die ultraviolette Absorptionskurve bei 280 Nanometern zur Grundlinie zurückkehrt und stabil wird. Eluieren Sie die AAV-Partikel aus der AVB Sepharose-Säule mit einem 50-Millimolar-Natriumcitrat-Puffer pH 3 bei einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute. Verdünnen Sie den AAV-Überstand sofort mit einem Fünftel Volumen von 500 Millimolar Tris HCl pH 8,0, um den sauren Elutionspuffer, der AAV enthält, zu neutralisieren.
Dies verhindert den pH-vermittelten Abbau, der bei saurem pH-3,0-Elutionspuffer auftreten könnte. Dann verdünnen Sie den AAV-Überstand zehnfach mit PBS, so dass sich AAV-Partikel in einem physiologischen Puffer befinden. Lagern Sie einen Milliliter jeder Säulendurchlaufproben, einen Waschpuffer und 100 Mikroliter des eluierten AAV-Überstands, um das Vorhandensein von AAV durch Infektion der Zielzellen zu bewerten.
Richten Sie das tangentiale Strömungsfiltrationssystem ein, das mit einer Polyethersulfon-Membrankartusche mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton ausgestattet ist, um den AAV zu konzentrieren. Führen Sie 200 Milliliter PBS für 10 Minuten aus, um das tangentiale Durchflussfiltrationsmodul auszugleichen. Laden Sie die AAV-Probe, indem Sie den Durchfluss der Pumpe steuern, bis die Probe auf das gewünschte Volumen reduziert ist.
Diafiltrieren Sie das Retentat mit 100 Milliliter PBS. Nachdem Sie die AAV-Probe auf das gewünschte Volumen konzentriert haben, sammeln Sie die AAV-Probe, filtern Sie sie durch einen 0,2 Mikrometer Polyethersulfonfilter und aliquotieren Sie sie. Anschließend lagern Sie die AAV-Probe bei minus 80 Grad Celsius.
Die meisten Sf9-Zellen infizierten sich innerhalb von drei bis vier Tagen mit dem Baculovirus, aufgrund der mehreren Infektionsrunden, die durch die Expression des Baculovirus-Glykoproteins gp64 belegt wurden. Die meisten Zellen zeigen auch eine Zunahme des Durchmessers. Die Zellen zeigen eine Zunahme des Durchmessers, eine zytopathische Wirkung, und etwa die Hälfte der Zellen stirbt fünf Tage nach der Infektion ab, was die Zeichen für den Abschluss der AAV-Produktion ist.
Ein Proteinpeak wurde bei der Elution mit einem sauren Puffer beobachtet, der der AAV-Fraktion entspricht. Die gereinigten AAV-Proben zeigen drei verschiedene Kapsidproteine: VP1, VP2 und VP3, nach SDS-PAGE und Silberfärbung. Der kritischste Schritt ist die Ernte der TIPS-Zellen vor der Kryokonservierung, wenn die meisten Zellen mit dem Baculovirus infiziert werden, mit einer minimalen Anzahl von Zelltod.
Wir haben hier die Herstellung und Aufreinigung des AAV-Vektors des Serotyps 2 als Modell beschrieben. Das Protokoll kann jedoch auch für andere AAV-Serotypen angewendet werden.
