Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist das Expressionsscreening eines multiplen Konstrukts von Protein-Arginin-Methyltransferasen in der Großproduktion, um die Milligrammmenge des Proteins für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien im mediumgestützten, kosteneffizienten Modus in der Abdeckung der Expressionsplattform S, Baculovirus-Expressionsvektorsystem zu erhalten. Dr.Alma Seitova wird die folgenden Schritte vorstellen. Verdünnen Sie die exponentiell wachsenden SF9-Zellen auf die endgültige Zelldichte von 0,4 Millionen Promille in den serumfreien Insektenmedien und gießen Sie sie in das sterile Reagenzreservoir.
Verwenden Sie eine programmierbare Mehrkanalpipette, um 0,5 mils der verdünnten SF9-Zellen in jede Vertiefung der 24-Well-Platte zu säen. Dieses Volumen reicht aus, um eine gleichmäßige Abdeckung der Arbeitsfläche des Brunnens zu gewährleisten. Gleichzeitig verdünnt es die Transfektionsmischung nicht zu sehr, was eine Transfektionseffizienz ermöglicht.
Kennzeichnen Sie eine Vertiefung der Platte nur als Zelle und verwenden Sie sie als Kontrolle für den Vergleich der transfizierten und nicht transfizierten Zelle, um mögliche Anzeichen einer Infektion zu beurteilen. Inkubieren Sie die Platten bei 27 Grad, bis etwa eine Stunde benötigt wird, damit sich die Zellen an den Zellkulturplatten anheften. Gut gemischtes Transfektionsreagenz in das unergänzliche Insektenmedium und ein steriles Reagenzreservoir verdünnen und 10 Sekunden lang vorsichtig mischen.
Übertragen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 102 Mikroliter des verdünnten Transaktionsreagenz in eine sterile 96 MicroWell-Platte. 10 Mikroliter 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter rekombinanter Bacmid-DNA in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-MicroWell-Platte geben und durch sanftes Schütteln mischen und die Platte von den Seiten klopfen. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung für 15 bis 20 Minuten für eine komplexe Formation.
Mit einer einstellbaren Sechskanalpipette, die für den Transfer zwischen einer 96- und einer 24-Well-Platte ausgelegt ist, überlagern Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen in entsprechenden Vertiefungen der Transfektionsplatten und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 27 Grad. Um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung über die Monoschicht der Zellen zu gewährleisten, schaukeln Sie die Platten während der Inkubationszeit mehrmals sanft hin und her. Vier bis fünf Stunden nach der Transfektionszeit 1,5 Mil serumfreie Insektenmedien hinzufügen.
Ergänzen Sie es mit 10% final hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Antibiotikum und Antimykotika. Inkubieren Sie die Zellen in einem 27-Grad-Inkubator für 72 bis 96 Stunden. Schaufeln Sie die Transfektionsplatten nach Möglichkeit einmal täglich vorsichtig.
Suchen Sie nach Anzeichen einer Infektion, die in transfizierten Zellen 72 bis 96 Stunden nach der Transfektion zeigen. Vier bis fünf Tage nach der Transfektion sollten Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen unter einem invertierten Mikroskop erkennbar sein, und die anfänglichen rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium sezerniert werden, sollten bereit sein, sich zu sammeln. Verwenden Sie einen programmierbaren elektronischen Mehrkanal, um gleichzeitig die Sammlung von P1-Viren, die Infektion von frisch gesäten SF9-Zellen bei der Infektion von Suspensionszellen in ihren 24 Brunnenblöcken mit 150 Mikrolitern der P1-Viren zu ermöglichen.
Spinnen Sie den Rest der kollektiven P1-Virusbestände für 15 Minuten herunter, bedecken Sie die 24 Bohrlöcher mit Suspensionskultur der infizierten SF9-Zellen mit einem AirPore-Blatt. Inkubieren Sie den 24-Well-Block bei 27 Grad mit Schütteln bei 245 U / min für 72 bis 96 Stunden. Vier Tage vor der geplanten Produktionszeit wurden exponentiell wachsende SF9-Zellen mit einer endgültigen Zelldichte von 2 Millionen Promille in Erlenmeyerglas-Schüttelseide mit Schallwänden in serumfreien Insektenmedien mit 1% endgültigem Antibiotikum und Antimykotika aufgeteilt.
Dieser Schritt erzeugt eine Suspensionskultur von infizierten Insektenzellen und P2-Viren im Überstand für die Infektion neuer Zellen in der Produktionscharge. Fügen Sie die entsprechenden P2-Viren hinzu und inkubieren Sie infizierte Zellen bei der niedrigeren Temperatur von 25 Grad, um das Zellwachstum zu verlangsamen, und schütteln Sie bei 165 U / min auf einem Orbitalschüttler mit einem Ein-Zoll-Schlag. Vier Tage vor der geplanten Produktionszeit säen zwei Liter exponentiell wachsende SF9-Zellen in insektenserumfreien Medien auf die Zelldichte von 1 Million Promille, in den 2,8-Liter-Fernbach-Schüttelkolben.
Schütteln Sie den Kolben bei 27 Grad mit schütteln bei 150 U / min. Forscher Ashley Hutchinson wird das folgende Protokoll demonstrieren. Vier Liter exponentiell wachsende SF9-Zellen und insektenserumfreie Medien bis zur endgültigen Zelldichte von 4 Millionen promille in die großen Fünf-Liter-Reagenzflaschen aufteilen.
Fügen Sie 10 bis 12 mils der Suspensionskultur der mit dem Baculovirus infizierten Insektenzellen hinzu. Inkubieren Sie die infizierte Kultur der SF9-Zellen in einem Shaker, der 72 bis 96 Stunden lang 145 U / min bei einer niedrigeren Temperatur von 25 Grad Celsius ausschüttet. Milligrammmengen mehrerer rekombinanter Proteine aus der PRMT-Familie exprimieren in der Baculovirus-Sofortproduktion in SF9-Zellen werden für biochemische biophysikalische Lehrstudien verwendet, wie in Abbildung fünf zu sehen ist.
Am SGC wurden Kristallstrukturen gelöst, die in der Proteindatenbank für die volle Länge oder abgeschnittene Formen der Proteine PRMT4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert wurden. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden hinterlegt, um die Gensammlung durch SGC hinzuzufügen und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung. In diesem Video haben wir Schlüsselelemente für ein erfolgreiches Expeditionsscreening ihres multiplen Konstrukts des Proteins Argininmethyltransferasen in der großtechnischen Produktion im Baculovirus-Expressionssystem hervorgehoben.
Die Verwendung der regulären einstellbaren und programmierbaren Mehrkanalpipetten machte ihren gesamten Prozess schneller als effizient. Die Verwendung von hochleistungsfähigen und weniger zelltoxischen für die Zellen, Transfektionsreagenz zur Erzeugung rekombinanter Viren führte zu einem kostengünstigeren und zellhandhabungsvolleren Transfektionsprotokoll. Die Infektion der groß angelegten Charge zur Proteinproduktion mit einer Suspensionskultur des Baculovirus, die in sechs Zellen infiziert ist, reduzierte die Arbeit in einem zeitaufwändigen Schritt bei der Vitalstarteramplifikation signifikant.
Ist zum Beispiel das Zentrifugieren mit spezieller Kultur infizierter Zellen. Das ist natürlich ausgeschlossen, die zusätzliche Handhabung der infizierten Zellen in ihrem engeren Virusabbau zu vermeiden. Die Aufrechterhaltung von Suspensionskulturkulturzellen in dieser Scale-up-Produktion im Kulturgefäß war ein hohes Feldvolumen, das uns half, die Begrenzung des Produktionsvolumens zu überwinden und eine große Plattform einzuführen.
Dies ist sehr nützlich für Labore ohne Zugang zu den Bioreaktoren oder begrenzten Platz in der Produktionspipeline. Obwohl unser Protokoll für die Proteine der Protein-Arginin-Methyltransferasen-Familie beschrieben wurde, kann der gleiche Ansatz auf jede andere Proteinfamilie angewendet werden, die eine Expressionsplattform benötigt, um eine ausreichende Menge ihres Proteins für biochemische biophysikalische Lehrstudien zu erhalten.
