Durch die Befolgung dieses Protokolls wird der Benutzer in der Lage sein, AAV-Vektoren von hoher Reinheit und Ausbeute zu produzieren, die für In-vitro- oder In-vivo-Anwendungen geeignet sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Reihe von AAV-Serotypen mit unterschiedlichen Konfigurationen zu erzeugen und zu reinigen. Das Kombinieren dieser beiden Elemente kann nützlich sein, um zelltyp- und gewebespezifische Expression zu erhalten.
Die Produktion einiger Serotypen kann zu einem geringeren Ertrag führen. Dies ist eine Produktion, in der es enge Serotypen gibt und individuell bewertet werden sollte. Die Technische Daten dieser Verfahren wird Shelly Fripont, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren.
Nach dem Anbau der HEK-Zellen mischen Sie 360 Mikrogramm Hilfsplasmid, 180 Mikrogramm Plasmid, das für das Vektorcapsid kodiert, und 180 Mikrogramm Plasmid, das das Transgen enthält, in 18 Milliliter 150 Millimollar-Natriumchlorid, um den DNA-Mix vorzubereiten. Verteilen Sie diese Mischung über drei 50 Milliliter konische Röhren. Mischen Sie in einer neuen konischen Röhre 840 Mikrogramm PEI und sechs Milliliter 150 Millimolarenatriumchlorid, um den PEI-Mix für sechs Zellkulturgerichte vorzubereiten.
Dann fügen Sie sechs Milliliter der PEI-Mischung, Tropfen für Tropfen, zu einem der konischen Röhren, die den DNA-Mix enthalten. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes entfernen Sie sechs Zellkulturgerichte aus dem Brutkasten.
In einer laminaren Strömungshaube, das Medium von jeder Schale vollständig aspirieren. Spülen Sie die Gerichte mit fünf Millilitern vorgewärmter DPBS, um Spuren des Mediums zu entfernen. Neigen Sie vorsichtig jede Schale, um sicherzustellen, dass DPBS gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt ist.
Dann, saugen Sie die DPBS vorsichtig an. Fügen Sie 12 Milliliter DMEM eins zu jeder Schale langsam, mit einer Pipette am Rand der Schale platziert. Mischen Sie die PEI- und DNA-Mischung, indem Sie sie drei- bis fünfmal nach oben und unten pipetieren.
Fügen Sie zwei Milliliter dieser Mischung zu jedem der sechs Zellkultur-Gerichte in einer Tropfen-für-Tropfen-Mode, um sicherzustellen, dass sorgfältig über die gesamte Oberfläche zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit sechs Zellkulturgerichten gleichzeitig, bis 18 Zellkulturgerichte erreicht sind. Schütteln Sie vorsichtig die Zellkultur-Gerichte, um die PEI-DNA-Mischung zu verteilen.
Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius mit 95 Prozent Luftfeuchtigkeit und fünf Prozent Kohlendioxid für fünf Stunden. Danach fügen Sie jedem der 18 Gerichte weitere 12 Milliliter DMEM 10 hinzu, ohne das bereits vorhandene Medium zu entfernen. Setzen Sie die Inkubation der transfizierten Zellen unter den gleichen Bedingungen fort.
Nach 72 Stunden nach der Transfektion verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sorgfältig von jeder Kulturschale zu lösen. Sammeln Sie das Medium und die Zellen von zwei Kulturgerichten in einer 15 Milliliter konischen Röhre, auf Eis gehalten. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 420 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, wobei die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf maximum eingestellt ist.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus jedem Rohr, indem Sie ihn vorsichtig in einen Entsorgungsbehälter gießen. Legen Sie dann die Rohre, die die Zellpellets enthalten, auf Eis. Wir hängen jedes Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer aus und mischen, indem wir fünf- bis zehnmal nach oben und unten pfeifen.
Ziehen Sie den AAV aus drei Rohren zusammen. Zunächst frieren Sie die wieder suspendierten Zellen ein, indem Sie sie in einen Eimer mit Trockeneis, das mit Ethanol vermischt ist, legen. Dann tauen Sie die Zellen auf, indem Sie sie sofort in ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius legen.
Wiederholen Sie diesen Gefrier- und Tauzyklus dreimal, um die Zellen zu lysieren und die AAV-Partikel freizusetzen. Nach dem dritten Auftauschritt zentrifugieren Sie bei 1167 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie die Überräube vorsichtig, um 50 Milliliter konische Rohre zu reinigen.
Fügen Sie jedem Rohr Nuklease zu einer Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter Überstand hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, während die Rohre alle 10 Minuten wirbeln, um sicherzustellen, dass die Nuklease gründlich mit dem Überstand gemischt wird. Zentrifuge bei 13490 mal G und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um den Überstand zu klären.
Danach entfernen Sie den Kolben einer 10-Milliliter-Spritze, befestigen Sie einen 0,45-Mikrometer-Filter an der Spritze und legen Sie ihn auf ein sauberes 50-Milliliter-Konusrohr. Füllen Sie die Spritze vorsichtig mit dem geklärten Überstand. Verwenden Sie den Kolben, um das Lysat durch den Filter zu erzwingen.
Als nächstes bereiten Sie jede der Iodixanol-Fraktionen in vier separaten 50 Milliliter konischen Röhren vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Pipette acht Milliliter von 15 Prozent Iodixanol in jedes der drei Ultrazentrifugenrohre. Pipette 5,5 Milliliter von 25 Prozent Iodixanol in eine saubere 50 Milliliter konische Röhre.
Mit einer nicht-graduierten Pasteur Pipette, sorgfältig Schicht 5,5 Milliliter von 25 Prozent Iodixanol Lösung unter der 15 Prozent Iodixanol-Lösung. Fügen Sie die Lösungen von 40 % und 60 % hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Iodixanol-Fraktionen sollten sich nicht bei der Schichtung vermischen.
Mit einer Pasteur-Pipette, Schicht das grobe Lysat auf die 15 Prozent Iodixanol Gradient, Tropfen für Tropfen, um zu vermeiden, stören die Schnittstelle zwischen dem rohen Lysat und der Iodixanol-Lösung. Füllen Sie jedes Ultrazentrifugationsrohr mit Lysepuffer, bis der Meniskus die Basis des Rohrhalses erreicht, um sicherzustellen, dass das Rohr nicht unter den sehr hohen Kräften zusammenbricht, die während der Ultrazentrifugation erzeugt werden. Schließen Sie die Rohre mit geeigneten Deckeln.
Stellen Sie mit einer digitalen Waage sicher, dass alle drei Ultrazentrifugationsrohre das gleiche Gewicht haben. Anpassen des Gewichts nach Bedarf, indem mehr Lysepuffer auf dem Rohlysat hinzugefügt wird. Verwenden Sie einen festen Winkel TitanRotor, um die Rohre bei 301580 mal G und bei 12 Grad Celsius für eine Stunde und 40 Minuten mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren.
Als nächstes befestigen Sie eine Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie den Abstandsraum aus den Rohren im Rotor, und bergen Sie die Rohre nach der Zentrifugalisierung zurück. Aspirieren Sie nur die 40-prozentige Iodixanol-Fraktion, die die Vektorpartikel enthält.
Verarbeiten Sie die Probe oder lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Hier wird ein Protokoll demonstriert, das zur Herstellung von AAV-Vektoren mit einer Vielzahl von Kapsiden, Genomkonfigurationen, Promotortypen und Transgenladungen verwendet werden kann. In diesem Beispiel haben wir zwei verschiedene AAV-Vektoren produziert und gereinigt, die das grüne fluoreszierende Protein aus einem selbstkomplementären Genom exprimierten.
Die beiden Vektoren unterscheiden sich durch verschiedene Capsids: PHPB und AAV9. Sie wurden mittels Schwanzveneninjektion in erwachsene C57-schwarze sechs Mäuse abgegeben. Um die Transgenexpression drei Wochen nach der Injektion zu bewerten, werden Abschnitte mit primären Antikörpern gegen GFP mit Detektion mit sekundären Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sind, gefärbt.
Fluoreszenzintensitätsmessungen zeigen eine signifikante Zunahme der GFP-Expression, wenn der PHPB-Vektor relativ zu AAV9 verwendet wird. Zuwächse in GFP wurden im Großhirn, im Kleinhirn und im Hirnstamm beobachtet. Die genaue Erfassung des Vektors, der den Bruch enthält, ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung.
Falls dies nicht richtig gemacht wird, werden die Vektorausbeute sowie die Vektorreinheit beeinträchtigt. In der Lage, AAV-Vektoren zu produzieren, werden kleine Labore in der Lage sein, zahlreiche experimentelle Möglichkeiten zu nutzen, um Gene im zentralen Nervensystem zu liefern. Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge und es ist wichtig, eine angemessene Schulung zu erhalten, bevor Sie dies behandeln, um Unfälle zu vermeiden.
Darüber hinaus werden AAV-Vektoren oft als Biogefahren eingestuft und daher sollten Sie lokale Vorschriften konsultieren, bevor Sie sie behandeln und verwalten.
