Lignin ist ein komplexes Heteropolymer, das aus drei Monolignolen besteht. Es ist neben Cellulose das zweithäufigste Polymer der Erde. Hier demonstrieren wir die Thioglykolsäure-Methode, die zuverlässigste Methode zur Abschätzung des Ligningehalts.
Diese Methode basiert auf dem Prinzip, dass Lignin durch Thioetherbindungen an Thioglykolsäure bindet. Darüber hinaus haben wir dieses Protokoll in fünf Phasen unterteilt. In der ersten Phase bereiten wir das Pflanzenmaterial vor.
In der zweiten Phase isolieren wir den alkoholunlöslichen Extrakt. In der dritten Phase fallen wir Lignin unter Verwendung von Thioglykolsäure und sauren Bedingungen aus. In der vierten Phase erstellen wir Lignin-Standardkurve mit industriellem Bambus-Lignin.
In der fünften Phase schließlich schätzen wir den Ligningehalt anhand der in der vierten Phase erstellten Standardkurve. Pflanzenmaterial wird gesammelt, die Töpfe umgedreht, um die Wurzeln zu trennen, sie gründlich in Wasser gewaschen, zwei Tage an der Luft getrocknet, in etikettierte Behälter überführt und im Inkubator bei 49 Grad Celsius für eine Woche bis 10 Tage inkubiert. Mit einer Schere wird das Gewebe weiter in 1 mm bis 3 mm große Stücke geschnitten.
Alternativ wird eine Biomassemühle verwendet, um das Pflanzengewebe zu zerkleinern. Verwenden Sie das Wurzelgewebe Schalten Sie die Biomassemühle ein und sammeln Sie das zerkleinerte Pulver in voretikettierten Behältern. Wiederholen Sie dies auch für das Stammgewebe und das Blattgewebe.
Das zerkleinerte Pulver wird in die Mahlvase geladen, die dann in die Gefriermühle gelegt wird und die Gefriermühle mit einer Geschwindigkeit von 10 CP für drei Zyklen laufen lassen. Wiegen Sie 20 mg des gemahlenen Gewebepulvers und geben Sie es in eine vorgefertigte 2ml-Tube. Notieren Sie sich die leere Tube und die Tube mit Gewebepulver und das Gewebepulver in Ihrem Labornotizbuch.
Inkubieren Sie die Schläuche mit einer bei 60 Grad Celsius geöffneten Kappe für eine Stunde. Nach der Inkubation 1,8 ml Wasser in jede Probenwirbelzentrifuge bei 15.000 U / min für 10 Minuten geben. Den Überstand entsorgen Fügen Sie 1,8 ml Methanol hinzu.
Wirbel und inkubieren in einem vorgewärmten 60-Grad-Zentrierblock für 20 Minuten Nach der Inkubationszentrifuge bei 15.000 U / min für 10 Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und die Pellets im Vakuumtrockner zwei bis drei Stunden oder bis die Palette vollständig trocken ist, trocknen.
Messen und notieren Sie das Gewicht jeder Tube in Ihrem Labornotizbuch für die Abschätzung des Ligningehalts am Ende. Enthalten sind an dieser Stelle auch positives industrielles Bambusligngnin von 0,5 mg bis 4 mg in Triplikaten. Fügen Sie 1 ml 3 normale Salzsäure zusammen mit hundert Mikrolitern Glykolsäure zu jeder Probe Vortex hinzu und inkubieren Sie bei 80 Grad Celsius für 3 Stunden.
Nach 3 Stunden Inkubation in ein Rack geben und 10 Minuten abkühlen lassen. dann zentrifugieren Sie bei 15.000 U / min für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation sieht die Farbe der Lösung so aus.
Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml Wasser hinzu. Vortex Zentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten.
Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml 1 normales Natriumhydroxid hinzu. Wirbel und inkubieren bei 37 Grad Celsius Shaker über Nacht.
Nach der nächtlichen Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 U/min für 10 Minuten. Die überstehenden frischen vormarkierten 2-ml-Röhrchen werden in den Überstand 200 Mikroliter konzentrierte Salzsäure geben. Mischen Sie sie durch sanfte Inversion, wie hier gezeigt.
Inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius im Kühlschrank. Nach der Inkubation Zentrifuge bei 15.000 U /min für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie 1 ml Natriumhydroxid hinzu. Wirbel und im Shaker bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten inkubieren. Verwenden Sie das Spektralphotometer, um die Absorptionswerte von 280 Nanometern zu erfassen, nehmen Sie 2 Mikroliter Natriumhydroxid als Rohling, da das ausgefällte Lignin in Natriumhydroxid gelöst ist.
Machen Sie das Leerzeichen auf Null. Wiederholen Sie dies auch für die Beispiele. Verwenden Sie zwei Mikroliter jeder Probe, um die Absorptionswerte in Ihrem Labornotizbuch zu sammeln.
Nehmen Sie drei Messwerte für jede Probe für drei technische Replikate. In der ersten Spalte haben wir die Beispielnummer. In der zweiten Spalte haben wir biologische Replikate, bei denen R1, R2, R3 drei biologische Replikate einer experimentellen Linie darstellen.
In der dritten Spalte haben wir die erhaltenen Absorptionswerte auf 280 Nanometer gemittelt. Wir haben den Ligningehalt in der vierten Spalte mit der Formel y=mx-c berechnet, wobei x der durchschnittliche OD ist.m und c-Werte aus der Regressionslinie der vorbereiteten Standardkurve gezeichnet werden. Die fünfte Säule ist das Gewicht nach dem Methanol und wassergewaschen.
Dies ist also die Art und Weise, die für die Schätzung des Ligningehalts in mg verwendet wird. Wir dividieren also den in der vierten Spalte erhaltenen Wert durch die fünfte Spalte, um den Wert pro mg Ligningehalt in der sechsten Spalte zu erhalten. Und dieser Wert wird mit 1000 multipliziert, um pro Gramm Zellwandgewicht zu erhalten.
Und der prozentuale Ligningehalt wird berechnet, indem dieser Wert durch 1000 dividiert und mit 100 multipliziert wird. Schließlich erhalten wir das durchschnittliche Lignin, indem wir das Lignin von drei biologischen Replikaten jeder experimentellen Linie mittelen, die mit dem Durchschnitt einer anderen experimentellen Linie in Form eines Balkendiagramms verglichen werden, um die Unterschiede im Ligningehalt zu verstehen. Wir können auch den Schüler-t-Test anwenden, um ihren Signifikanzgrad zu testen.
In Spalte A haben wir kommerzielles Bambuslignin und dann das Gewicht des Bambuslignins, das vor TGA aufgenommen wurde, und ihre jeweiligen Absorptionswerte bei 280 Nanometern. Diese Werte in Tabelle A wurden verwendet, um ein verstreutes Diagramm in Spalte B darzustellen, das uns die Regressionslinie mit m- und c-Werten gibt. In C verglichen wir die Werte, die mit der Standardkurve erhalten wurden, und die industrielle Bambus-Lignin-Versuchslinie eins und zwei wurden in Form eines Balkendiagramms verglichen und das Ergebnis ist, dass sie Unterschiede untereinander zeigen.
