Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle spezifischer einzelner molekularer Ziele bei der Regulierung der elektrokortikographischen Aktivität während verschiedener Vigilin-Zustände zu identifizieren. Zu den Vorteilen der Verwendung von Adeno-assoziierten Viren gehört die Fähigkeit, eine bestimmte Gehirnregion und einen bestimmten Zelltyp genau anzusprechen. Das Protokoll wird von Julien Dufort-Gervais, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Team, demonstriert.
Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Zehenquemmreflex bei einer betäubten 12 Wochen alten Maus bestätigt haben, verwenden Sie einen Haarschneider, um die Haare von der Rückseite der Ohren bis zur Vorderseite des Kopfes zwischen den Augen zu rasieren. Fügen Sie jedem Auge einen großzügigen Tropfen Augensalbe hinzu, um Austrocknung zu verhindern, und verwenden Sie die Ohrbügel, um den Kopf der Maus vorsichtig auf einem stereotaxischen Apparat zu befestigen. Ziehen Sie vorsichtig die Zunge aus dem Mund, um ein Ersticken zu vermeiden.
Befestigen Sie die Nase der Maus am Gerät und verwenden Sie 70% Ethanol, um die freiliegende Haut auf dem Kopf zu sterilisieren. Halten Sie die Haut mit einer extrafeinen Graefe-Pinzette, schneiden Sie die Haut mit einer Gewebeschere von der Basis der Ohren bis zur Höhe der Augen und legen Sie zwei chirurgische Klemmen auf jede Seite des Schnitts, um die Haut zu dehnen und den Schädel freizulegen. Vermeiden Sie Gehirnnähte, verwenden Sie eine Scherenspitze, um die Schädeloberfläche zu kratzen, um das Periost zu entfernen und überlappende Streifen in zwei oder mehr Richtungen zu erzeugen.
Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Knochenfragmente zu entfernen und den Schädel zu desinfizieren. Identifizieren Sie mit einer zuvor vorbereiteten Kanüle, die am stereotaxischen Arm befestigt ist, die Position der Bregma und des Lambda und notieren Sie die stereotaxischen Koordinaten von jedem. Verwenden Sie den stereotaktischen Arm und einen Stift, um die Position der Kanüle auf dem Schädel 1,5 Millimeter seitlich bis zur Mittellinie und 1,5 Millimeter vor der Bregma zu markieren.
Durchstechen Sie den Schädel vorsichtig mit einem 0,7-Millimeter-Bohrer an der markierten Position senkrecht zur Schädeloberfläche und ausgerichtet an der vertikalen Achse und waschen Sie den Schädel mit einer sterilen Baumwollspitze, die in einer 10% Betadin-Povidon-Jodlösung getränkt ist, und ziehen Sie dann den Kolben einer 10-Mikroliter-Spritze um ein Mikroliter zurück, um die Kanüle mit einer Luftblase von einem Mikroliter zu beladen. Als nächstes mischen Sie die AAV-Mischung von Interesse mit langsamem Pipettieren und fügen Sie 1,7 Mikroliter der Mischung zu einer sterilen Petrischale hinzu. Verwenden Sie diese Spritze, um 1,5 Mikroliter der Lösung in die Kanüle zu laden und die Position der Luftblase auf dem angeschlossenen PE50-Rohr zu markieren.
Richten Sie die Kanüle vertikal mit dem Loch im Schädel aus, so dass die Kanüle den oberen Rand des Knochens erreicht und markieren Sie die Z-Koordinate der Schädeloberfläche. Senken Sie die Kanüle langsam, bis die Spitze 1,5 Millimeter unter der Schädeloberfläche und Schicht fünf des motorischen Kortex erreicht, und starten Sie die Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,025 Mikroliter pro Minute, um einen Mikroliter AAV über 40 Minuten zu liefern. Verwenden Sie die Luftblase im Rohr, um die Injektion zu verfolgen, und machen Sie bei Bedarf Anpassungen.
Wenn das gesamte Virusvolumen abgegeben wurde, lassen Sie die Kanüle fünf Minuten lang an Ort und Stelle, um eine ausreichende Diffusion zu gewährleisten und einen Rückfluss zu vermeiden, bevor Sie den stereotaktischen Arm langsam und vorsichtig anheben, um die Kanüle aus dem Kortex zu entfernen. Verwenden Sie für die Elektrodenimplantation eine gerade Kelly-Pinzette, um langsam eine elektrokortikographische Elektrode mit einem geraden Golddraht in die vertikale Achse des Lochs zu schrauben, in das das AAV injiziert wurde, wobei mindestens 2,5 Millimeter Schraube außerhalb des Schädels übrig bleiben, um die Schädigung der Dura und der Großhirnrinde zu minimieren. Verwenden Sie einen Stift, um die Position der Referenzelektrode 2,6 Millimeter seitlich rechts zur Mittellinie und 0,7 Millimeter posterior zu Bregma und die Position der hinteren elektrokardiographischen Elektrode bei 1,5 Millimetern seitlich rechts zur Mittellinie und 1,5 Millimetern anterior zu Lambda und die Positionen von drei Wartungsschrauben auf der linken Hemisphäre ohne spezifische Koordinaten zu markieren. aber so weit wie möglich voneinander und von den elektrokortikographischen Elektroden entfernt.
Verwenden Sie den Bohrer, um den Schädel senkrecht zur Schädeloberfläche an den markierten Positionen der anderen Elektroden und Schrauben vorsichtig zu durchbohren und den durchbohrten Schädel mit einer 10% Povidon-Jodlösung zu waschen. Blockieren Sie die Löcher mit kleinen gerollten Stücken mit empfindlichem Aufgabenwisch, bevor Sie die Schrauben installieren, um Blutungen und Verunreinigungen zu verhindern, und verwenden Sie eine gerade Kelly-Stoßzette, um die Schrauben in den Bohrlöchern in demselben Winkel einzusetzen, in dem die Löcher durchbohrt wurden. Legen Sie ein paar kleine Tropfen Zahnzement in die Mitte des ringartigen Raums in den Schrauben und verwenden Sie eine extrafehe Graefe-Stoßzette, um die Haut über die Nackenmuskulatur zu heben.
Halten Sie mit der Dumont-Zette Nummer fünf die gekrümmte Extremität einer elektromyographischen Elektrode und führen Sie sie etwa ein bis zwei Millimeter in die Muskeln ein. Legen Sie die gekrümmte Seite und den Faltpunkt der Elektrode in den Dentalzement und führen Sie die zweite elektromyographische Elektrode auf die gleiche Weise ein. Nachdem Sie die Augen des Tieres bedeckt haben, tragen Sie drei bis fünf Minuten lang Licht auf, um den Zement zu verfestigen, und verwenden Sie zusätzlichen Zahnzement, um die Basis der elektrokortikographischen Elektroden und die Ankerschrauben zu bedecken, um eine kronenförmige Kontur zu bilden.
Nachdem Sie drei bis fünf weitere Minuten Licht aufzutragen haben, füllen Sie die Mitte der Montage mit Acrylzement und entfernen Sie die chirurgischen Klemmen. Verwenden Sie eine synthetische resorbierbare Monofilamentnaht, um die Haut an der Vorder- und Rückseite der Montage zu schließen, so dass der Schädel nicht freigelegt wird, und verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um den Stecker über der Montage zu halten, um die Golddrähte der Elektroden vorsichtig mit den Anschlussstiften auszurichten, und löten Sie dann schnell jede Elektrodenextremität an einen einzigen entsprechenden Anschlussstift. Nachdem Sie die Maus aus dem Rahmen entfernt haben, bedecken Sie den leeren Raum zwischen dem Stecker und dem Kopf mit dem Acrylzement.
Und nach dem Wiegen legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig mit einem nicht vermaschten Deckel auf einem Wärmekissen. Schließen Sie die Mäuse zwei Wochen nach der Operation an Aufzeichnungskabel an und zeichnen Sie mindestens eine Woche später die elektrokortikographischen und elektromyographischen Signale für 24 Stunden oder länger auf. Eine erfolgreiche Infektion wird durch HA-Färbung der Neuronen innerhalb des motorischen Kortex, der die Injektionsstelle umgibt, bestätigt, was auf das Vorhandensein von Cofilin S3D HA hinweist. Die Co-Färbung mit dem exzitatorischen Neuronenmarker CaMKII alpha zeigt eine klare Cofilin S3D HA und CaMKII alpha Co-Expression unter hoher Vergrößerung.
Log-transformierte relative Leistungsspektren für Wachheit, langsamen Wellenschlaf und paradoxen Schlaf zeigen zustandsspezifische Unterschiede in der spektralen Aktivität unter Cofilin-Inaktivierung. Die Kombination aus elektrokortikographischer Aufzeichnung und AAV-vermittelter Manipulation präziser molekularer Targets ist neben dem Schlaf auch auf mehrere Hirnregionen und auf andere neurowissenschaftliche Teilbereiche wie epilepsie- oder Gedächtnisforschung anwendbar.
