Angesichts der explosionsartigen Zunahme neuer Materialien für medizinische Anwendungen sollte das erste Screening systematisch durchgeführt werden, so dass dieses Protokoll ein grundlegendes Werkzeug für Forscher sein kann, die neuartige Biomaterialien entwickeln und charakterisieren wollen. Die Methodik ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zytotoxizität und Bioaktivität von Biomaterialien und pharmazeutischen Formulierungen, sowohl fest als auch flüssig. Nach der Zellexposition können mehrere komplementäre Assays durchgeführt werden.
Die Etablierung der Zytotoxizität von Biomaterialien kann relevante Implikationen für die klinische Praxis haben. Dieses Wissen kann den Arzt beispielsweise in die Lage versetzen, das am besten geeignete Biomaterial für einen bestimmten Patienten oder eine bestimmte Erkrankung auszuwählen. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung neuartiger Biomaterialien in verschiedenen Bereichen wie Zahnmedizin, Orthopädie, Chirurgie, Augenheilkunde, Kardiologie und anderen.
Die Evaluierungsleistung sollte neben der Zytotoxizität auch Rückschlüsse auf die Bioaktivität des Biomaterials in lebenden Geweben zulassen. Legen Sie das frisch zubereitete Biomaterial so kurz wie möglich zu Beginn des Experiments mit einem Spatel in die PVC-Formen und lassen Sie das Material für die entsprechende Zeit bei Raumtemperatur aushärten. Wenn das Material fest geworden ist, nehmen Sie die Pellets aus den Formen und legen Sie sie in einen Behälter geeigneter Größe.
Sterilisieren Sie dann die Pellets unter einer UV-Lichtlampe für 20 Minuten pro Seite. Um die Biomaterialien aus den Pellets zu extrahieren, geben Sie die sterilisierten Pellets in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie den Pellets das entsprechende Zellkulturmedium hinzu. Legen Sie die Röhrchen für 24 Stunden auf 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie am nächsten Tag frisches Medium, um den Extrakt auf die entsprechenden Mengen zu verdünnen. Um die Zellmorphologie als Reaktion auf die Exposition gegenüber Biomaterial zu bewerten, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um ein steriles Glasdeckglas in geeigneter Größe in jede Vertiefung einer Multi-Well-Platte zu legen. Fügen Sie jedem Deckglas Zellen in einer ausreichenden Konzentration hinzu und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator.
Geben Sie das entsprechende Volumen der interessierenden Extraktverdünnung in jede Vertiefung und geben Sie die Zellen für die entsprechende Inkubationszeit in den Zellkulturinkubator zurück. Am Ende der Inkubation wird der Überstand aus jeder Vertiefung abgesaugt, damit die Deckgläser bei Raumtemperatur trocknen können. Wenn die Proben getrocknet sind, bedecken Sie jedes Deckglas mit einer ausreichenden Menge May-Grunwald-Lösung für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie den Farbstoff entfernt haben, waschen Sie die Deckgläser eine Minute lang mit einer geeigneten Menge destilliertem Wasser, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in einer ausreichenden Menge Giemsa-Lösung. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Deckgläser unter fließendem Wasser und bilden Sie die Zellen lichtmikroskopisch ab. Um die Zellfunktion durch die Bewertung der Proteinexpression nach Exposition gegenüber dem interessierenden Biomaterial zu beurteilen, waschen Sie jede Vertiefung der Zellen mit PBS, bevor Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3,7 % Paraformaldehyd fixieren.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal mit PBS und permeabilisieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 0,5 % Triton in PBS. Am Ende der Permeation blockieren Sie die Peroxidase mit 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS für fünf Minuten, gefolgt von zwei Waschgängen mit PBS. Waschen Sie die Zellen nach der zweiten Wäsche zweimal mit 0,5 % BSA, bevor Sie die unspezifische Bindung mit 2 % BSA für 45 Minuten blockieren.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation einmal mit 0,5 % BSA, bevor Sie die Zellen mit einem primären Antikörper gegen das gewünschte Protein 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von fünf Waschgängen mit frischem 0,5 % BSA. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen mit dem entsprechenden Sekundärantikörper 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von fünf einminütigen Waschungen in 0,5 % BSA. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen mit einem geeigneten Substrat und einer Chromogenmischung bei 20 Mikrolitern Chromogen pro Milliliter Substratkonzentration für 25 Minuten inkubiert.
Am Ende der Inkubation werden die Kulturen zweimal mit 0,5 % BSA in PBS gewaschen und die Zellen 15 Minuten lang mit Hämatoxylin gegengefärbt. Waschen Sie die gegengefärbten Zellen fünf Minuten lang mit 0,037 Mol pro Liter Ammoniak. Waschen Sie dann fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und verwenden Sie Glycerin, um die Deckgläser auf Objektträgern zu montieren.
Um die Bildung von mineralisierten Ablagerungen in den mit Extrakt behandelten Zellkulturen zu beurteilen, waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit PBS, bevor Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4%Paraformaldehyd fixieren. Nach der letzten Wäsche färben Sie die Zellen mit einer entsprechenden Menge Alizarinrot-Färbelösung für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie die Vertiefungen am Ende der Inkubation mit PBS, bis der überschüssige Farbstoff vollständig entfernt ist, und bilden Sie die Zellen lichtmikroskopisch ab.
Geben Sie dann Extraktionslösung für eine 40-minütige Inkubation unter Rühren bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und messen Sie die Absorption in jeder Vertiefung auf einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 490 Nanometern. Mit einem MTT-Assay kann man sich schnell und unkompliziert einen Überblick über die Zytotoxizität der Materialien verschaffen, gemessen an ihren Auswirkungen auf die Stoffwechselaktivität. Zellviabilitätsanalysen ermöglichen auch die Bewertung der Zytotoxizität eines Materials von Interesse, da Materialien mit höherer Zytotoxizität bei gleicher Konzentration einen höheren Prozentsatz des Zelltods induzieren.
Reduktionen von mehr als 30 % gelten als kritisch und definieren Materialien als gefährdet für eine geringe Biokompatibilität. Darüber hinaus sind mehr zytotoxische Materialien durch eine akzentuierte Abnahme der Zellviabilität und ein spätes Apoptose- und Nekrose-Zelltodprofil gekennzeichnet, während weniger zytotoxische Materialien weniger Zelltod und ein apoptotischeres und spätapoptotisches Profil induzieren. Die morphologische Bewertung ergänzt die Bewertung der Zellviabilität, da Veränderungen in der Zellmorphologie auf ein apoptotisches oder nekrotisches Profil hinweisen und das Vorhandensein von Materialpartikeln aufdecken können.
Darüber hinaus können die Auswirkungen von Materialien von Interesse auf die Proteinexpression unabhängig von den Auswirkungen auf die Viabilität beobachtet werden. In dieser Analyse induzierte beispielsweise ein Material einen Anstieg der Proteinexpression, während das andere eine signifikante Abnahme förderte. In beiden Fällen beeinflusste die Konzentration der Extrakte direkt die Proteinexpression.
Bei der Herstellung der Extrakte ist ein geeignetes Verhältnis von Oberfläche zu mittlerem Volumen des Biomaterials von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus müssen die Proben mit Methoden sterilisiert werden, die ihre Eigenschaften nicht verändern. Ein weiteres Detail, das Sie sich merken sollten, ist der pH-Wert der Extrakte, der ohne Anpassung registriert werden sollte.
Führen Sie bei Bedarf zusätzliche Kontrollen durch. Die Biomaterialextrakte können für chemische und biochemische Studien sowie für verschiedene andere molekularbiologische Techniken verwendet werden. Die erzielten Ergebnisse bilden die Grundlage für zukünftige In-vivo-Biokompatibilitätstests.
Die Bewertung der Zytotoxizität ist entscheidend für die Entwicklung von Materialien, die für medizinische Zwecke bestimmt sind. Daher bietet dieses Protokoll einen systematischen und umfassenden Ansatz zur Bewertung neuer Biomaterialien oder neuer Anwendungen anderer, bereits vorhandener Biomaterialien in verschiedenen medizinischen Bereichen.
