Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie. SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von rund 100 Nanometern erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.
Der Schlüssel zur Ermöglichung der Analyse auf einer Super-Resolution-Ebene sind jedoch die bei der Erfassung verwendeten Reagenzien, wie z. B. kammerförmige Abdeckungen und Montagelösungen, die mit dem Beugungsindex des Ziels kompatibel sind. Um eine Maus Hippocampus primäre Neuron zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1 zu P4 Welpen. Plattenzellen bei 70.000 Zellen pro Brunnen bei einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Brunnen.
Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus 12 bis 14 Tage nach der Beschichtung vollständig ausgereift sind, um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen. Fügen Sie 4%Paraformaldehyd, PFA, in PBS 200 Mikroliter pro Brunnen zu Neuronen, um sie schnell zu beheben. Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1%rinderserumalbumin, BSA, in PBS bei 200 Mikroliter pro Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur, um alle frei bindenden Oberflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken.
Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als derselbe Puffer mit 0,2% Triton X-100. Fügen Sie den primären Antikörper hinzu. Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen.
Mount zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant, z.B. ProLong Glass Antifade Mountant. Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas, z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von acht Millimetern.
Quadratische können auch verwendet werden. Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei Raumtemperatur auf und warten Sie mindestens 48 Stunden, bevor Sie Bilder erfassen. Diamantglas erfordert mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution Akquisitionen.
Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Der erste ist die Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Antikörpern, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder die zur Erhöhung des Antikörpers.
Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM-Superauflösungsmikroskop von Nikon für unsere Analyse. Die folgenden Anweisungen sind für die Erfassung von SIM-Bildern unabhängig vom Einsatzmikroskop zu verwenden. Es ist auch wichtig, die Leistung des Mikroskops zu maximieren, um eine genaue Kalibrierung der Instrumente durchzuführen, einschließlich Korrekturring, Laserausrichtung und Gitterblockfokussierung.
Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.
In einem Wasserbad etwa 1,8 mal 10 mal 10 Bis zu den 8. fluoreszierenden Mikrosphären für 10 Minuten beschallen. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären eins zu 500 in doppelt destilliertem Wasser. Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.
Pipette 15 Mikroliter der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerierten Deckelrutsches. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Montagelösung hinzu, z.B.
ProLong Glass, und legen Sie einen acht Millimeter Abdeckungslip auf der Oberseite. Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.
Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen, und das SIM-Superauflösungsmikroskopsystem benötigt mindestens drei Stunden. Wählen Sie das 100X-Ziel aus. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten.
Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel. Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf des Mikroskops zur Betrachtung ein. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckschdicke ein, indem Sie die objektive Korrekturabdeckung anpassen.
NIS Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM-Super-Auflösungsmikroskop-Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion, um die Korrektur von Farben zu regulieren. Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.
Erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Berechnen Sie für jede einzelne Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.
Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte nun in der Nähe von 100 Nanometern seitlich sein. Führen Sie die Kanalregistrierung durch Überlagern einer Mehrkanalerfassung der Mikrosphären durch.
Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich. Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung, indem Sie den Funktionen Beleuchtungsphasenschritt und Beleuchtungsmusterfokus von SIMcheck verwenden, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ.
Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation der Probe, die Aufrechterhaltung guter Details und ein großes Sichtfeld. Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu erkennen, der neuronale Prozesse darstellt.
Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Wechseln Sie zum Ziel 100X. Öl auf das 100X-Objektiv auftragen.
Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des superaufgelösten Bildes zu bewerten. Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus. Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um die Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren.
In der Regel ist 16 Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen Niederfrequenzwert für die Erfassung, z. B. einen Megahertz. Mit Histogrammfenstern, setzen Sie die Laserleistung, um eine lineare Signalantwort zu erhalten, um Informationsverlust zu vermeiden, gesättigte Pixel in den Bildern zu begrenzen.
Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16 Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45 000 auswählen, um den Dynamikbereich der Akquisitionen zu maximieren.
Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Bildgebung der Proben und der Belichtungszeiten zwischen 50 Millisekunden und zwei Sekunden ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen. Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.
Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassungen der Rohbilder zu bewerten. Wenn SIMcheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus vollständigen technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen. Erworbene Bilder sind Rohdaten, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte SIM-Bilder zu erhalten, die für weitere Analysen verwendet werden.
Im Protokoll empfehlen wir, Synaptophysin und PSD-95 als Prä- und Post-Synaptische Marker zu verwenden. Es können jedoch zusätzliche Marker verwendet werden. Ein riesiger Teil der Literatur unterstützt die Verwendung anderer Proteine, wie Drebrin und Fagott als synaptische Marker.
3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.
Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten. Alternativ können Sie ein frei verfügbares ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um die Rohbilder zu rekonstruieren. Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMcheck.
Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen können, starten Sie die Rohbilder neu, und rekonstruieren Sie sie, indem Sie Rekonstruktionsparameter wie lineare Filterung, Apodisierung und Unterdrückung der Nullreihenfolge ändern. In der NIS-Software können Sie mithilfe der Vorschau überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, ändern Sie den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation des Parameters, die hochauflösende Rauschunterdrückung und die Unterdrückung von Fokus.
Analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL, ein ImageJ-basiertes Plugin, verwenden, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten. In unserer Analyse der Co-Lokalisierung haben wir zwei Ansätze verwendet. Der erste ist ein visueller Ansatz, der auf der Profilanalyse basiert, die einzelne Ereignisse der Kolokalisierung anzeigt und den Beitrag jedes Kanals identifiziert.
In einem ersten Schritt, um die Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse zu untersuchen, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappungen zu bestimmen. Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild. Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale zum Ort des Interesses.
Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander durchgeführt werden. Verwenden Sie JACoP, ein ImageJ-Plugin, um zwei Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen, Pearson es und Mander's. Nachdem wir das System kalibriert und die Qualität der rekonstruierten Bilder bewertet hatten, begannen wir als nächstes, die primären neuronalen Kulturen zu analysieren, die mit einem Antikörper gegen MAP2, einen neuronalen Marker, PSD-95, einen postsynaptischen Marker und unser Zielprotein SUMO1 gefärbt waren.
Wir analysierten zuerst die Probe, die eine vierkanalige konfokale Mikroskopie mit einem 40-Fach-Objektiv durchführte. Bei der Auswahl eines Bereichs, der neuronale Prozesse darstellt, haben wir auf ein 100-Fach-Ziel umgestellt. Wir haben sowohl Konfokal- als auch SIM-Bilder aus dem gleichen Bereich erworben, um die Qualität der Rekonstruktion mit NanoJ-SQUIRREL zu bewerten und eine Co-Lokalisierungsanalyse durchzuführen.
Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis sowohl physiologischer als auch pathologischer Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie sind auch die Grundlage für komplexe neurologische Erkrankungen, wie eine der häufigsten Formen der Demenz Alzheimer-Krankheit. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Proteinzusammensetzung von Synapsen mit einer superauflösenden Mikroskopietechnik, der so genannten strukturierten Beleuchtungsmikroskopie.
