DetectSyn nutzt die Proximity-Ligations-Assay-Technologie, um Veränderungen an Synapsen schnell zu identifizieren. Wir stellen auch ein Protokoll zur Verfügung, um die Ergebnisse zu analysieren. Der Hauptvorteil von DetectSyn besteht darin, wie schnell die Ergebnisse in den großen Geweberegionen erzielt werden können, die analysiert werden können.
Entfernen Sie zunächst vorsichtig die blockierende Lösung mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff, ohne die Zellen zu stören. Dann eine große Plastik-Petrischale mit Parafilm auslegen. Und mit einer Pinzette die Deckscheine vorsichtig auf den Parafilm übertragen.
Fügen Sie 60 Mikroliter der primären Antikörperlösung auf die Oberseite des Deckglases hinzu, um sicherzustellen, dass die Antikörperlösung nicht über die Seiten des Deckglases verschüttet. Um Feuchtigkeit zu spenden und zu verhindern, dass Proben während der Inkubation austrocknen, fügen Sie einer kleineren Petrischale Reinstwasser hinzu und legen Sie die Schale vorsichtig um die Deckblätter. Dann die größere Petrischale abdecken und die kultivierten Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper verwenden Sie eine Pinzette, um die primäre Antikörperlösung vorsichtig von den Deckgläsern auf ein Papiertuch abzuklopfen und die Deckzettel auf ihre ursprüngliche 24-Well-Platte zu übertragen, die mit 500 Mikrolitern PBS gefüllt ist. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten mit sanftem Rühren auf einem Orbitalschüttler. Nach dem letzten Waschen die Deckblätter zurück in die große Petrischale geben und 40 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung auf die Oberseite des Deckglases geben.
Decken Sie die Petrischale ab und inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Für die Ligatur, während Sie die Ligase auf einem kalten Block halten, verdünnen Sie die Ligase 1 bis 40 mit dem Ligationsmaterial und fügen Sie sofort 40 Mikroliter der Ligasemischung zu den Deckgläsern hinzu. Die Petrischale abdecken und die Proben bei 37 Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren.
Zur Amplifikation verdünnen Sie die Polymerase 1280 auf einem kalten Block mit dem Verstärkungsmaterial. Geben Sie dann 40 Mikroliter der Verstärkungsmischung zu den Deckgläsern und inkubieren Sie die Proben für 100 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes lassen Sie für die Montage drei Mikroliter Montagemedien auf einen Objektträger fallen.
Klopfen Sie überschüssigen Waschpuffer vom Deckglas ab und legen Sie den Deckzettel mit den Zellen nach unten in das Montagemedium. Versiegeln Sie die Seiten mit einer kleinen Menge klarem Nagellack, um den Deckzettel an Ort und Stelle zu halten. Für die Montage von geschnittenem Gewebe eine Gewebescheibe vorsichtig auf den vorbereiteten Objektträger geben und flach legen.
Dann lassen Sie 5 bis 10 Mikroliter Montagemedien auf die Gewebescheibe fallen. Legen Sie einen Glasdeckel über die Gewebescheibe und verschließen Sie den Decklack mit klarem Nagellack, wie bereits gezeigt. Für die digitale Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop passen Sie die Verstärkung, den Offset und die Laserleistung für jeden Fluoreszenzkanal an, um Hintergrundrauschen zu verringern und das Fluoreszenzsignal zu verbessern.
Stellen Sie sicher, dass das fluoreszierende Signal nicht übersättigt ist. Klicken Sie für die Kulturneuronen auf der Registerkarte ND-Akquisition auf In Datei speichern. Wählen Sie dann unter Durchsuchen eine Datei aus, in der das Bild gespeichert werden soll, und geben Sie den Dateinamen ein.
Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte Z die Option Symmetrischer Modus definiert durch Bereich aus. Setzen Sie den Fokus auf die beste Karte mit zwei Ebenen und klicken Sie auf die Schaltfläche Relativ, um diese Fokusebene als Mitte des Z-Stapels festzulegen. Stellen Sie als Nächstes den Bereich auf fünf Mikrometer mit einem Mikrometerschritt ein und aktivieren Sie Close active Shutter während der Z-Bewegung.
Wählen Sie auf der Registerkarte Wellenlänge unter Optische Konfiguration den Namen der optischen Schaltfläche mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen aus und klicken Sie auf Jetzt ausführen. Wählen Sie für geschnittenes Gewebe im Aufnahmemenü die Option "Großes Bild scannen" und wählen Sie dann im Aufnahmebereich die optische Taste mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen aus. Wählen Sie in diesem Bedienfeld auch das richtige Ziel aus.
Verwenden Sie als Nächstes unter dem Bereichsfenster und dem Okular die Pfeiltasten, um die Grenzen der Region von Interesse oder des ROI festzulegen. Klicken Sie dann auf Großes Bild in Datei speichern und erstellen Sie einen Speicherpfad-Dateinamen für das Bild. Stellen Sie abschließend im Setup-Bedienfeld sicher, dass Multichannel Capture aktiviert ist.
Wählen Sie dann unter Optische Konfiguration den Namen der optischen Taste mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen. Öffnen Sie in ImageJ die Schwellenwertoption, indem Sie zum Bildmenü gehen, auf Anpassen und dann auf Schwellenwert klicken. Wählen Sie die Option "Dunkler Hintergrund", wenn das Bild einen dunklen Hintergrund hat.
Passen Sie als Nächstes die oberen und unteren Grenzen des Schwellenwerts gemäß den zuvor festgelegten optimierten Schwellenwerteinstellungen an und klicken Sie auf Übernehmen. Verwenden Sie für kultivierte Zellen den MAP2-Kanal und ein ROI-Tool für freie Hand, um einen ROI für jedes Neuron zu zeichnen, einschließlich Dendriten und Soma. Zeichnen Sie für geschnittenes Gewebe einen ROI mit freier Hand innerhalb des Slice-Bildes, der den interessierenden Bereich kapselt.
Rufen Sie dann den Bereich des ROI ab, indem Sie das Menü Analysieren öffnen und auf Messen klicken. Um die Anzahl der Punta innerhalb jedes ROI zu ermitteln, verwenden Sie ein automatisches Erkennungstool wie die Partikelanalyse. Wählen Sie im Menü Analysiert die Option Analysierte Partikel und definieren Sie den Durchmesser der Punctagröße.
Wählen Sie als Nächstes aus dem Dropdown-Menü Show die Option Overlay Masks, aktivieren Sie dann die Option Ergebnisse anzeigen und klicken Sie auf OK. Um die Anzahl der Punta durch die Fläche des einzelnen ROI zu teilen, kopieren Sie die Ergebnisse für jedes Bild aus dem Ergebnis-Popup und fügen Sie sie in eine Tabelle ein. Identifizieren Sie, aus welcher Datei und Stichprobe die Daten stammen, aus denen wir stammen, und teilen Sie den Bereich des ROI durch die Anzahl der Punta.
Um schließlich die Ergebnisse auf Kontrollproben zu normalisieren, werden die Ergebnisse für die Kontrollproben gemittelt und die erhaltenen Ergebnisse aller Proben durch den Durchschnitt der Kontrollprobe dividiert. Der GABAB-Agonist Baclofen wird für die In-vitro-Wirksamkeit des schnellen Antidepressivums Ro-256981 benötigt. Eine Zunahme der Synapsenbildung wird durch eine Zunahme der weißen Punta nachgewiesen.
Ohne Baclofen ist keine Zunahme der Synapsenbildung zu sehen. In vivo führt die intraperitoneale Injektion des schnellen Antidepressivums zu einer Zunahme der Synapsenbildung im Vergleich zur Kochsalzkontrolle. Während einige Punta in den technischen Kontrollbildern erscheinen, haben sie im Allgemeinen nicht die gleiche Größe, wie die weiße Spezifikation zeigt, verglichen mit der großen Punta in den anderen Panels.
Außerdem befinden sich diese Punta nicht an der gleichen Stelle, wie einige Punta zeigen, die innerhalb des Soma erscheinen. DetectSyn kann Veränderungen an Synapsen aufgrund eines Krankheitszustands oder einer medikamentösen Behandlung erkennen. Diese Methode kann dazu beitragen, Einblicke in jedes Forschungsgebiet zu geben, das die Störungen untersucht, die die Entwicklung oder den Abbau von Synapsen beeinflussen.
