Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen über die Dynamik der neuronalen Vorläuferzellen und ihre Nachkommen zu beantworten, die der Entwicklung des Wirbeltierhirns zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, mehrere Cluster von klonal verwandten Zellen innerhalb des lebenden Gehirns über viele Stunden der Entwicklung direkt zu visualisieren. Das Protokoll kann auch auf die Untersuchung der Clonal- und Vorläuferdynamik in anderen sich entwickelnden Systemen des Zebrafisch-Embryos angewendet werden.
Die Visualisierung mit dieser Methode ist besonders nützlich, um grundlegende Prozesse, die während der neuronalen Entwicklung auftreten, direkt zu beobachten. Am Nachmittag vor der Durchführung von Mikroinjektionen, richten Sie wilde Typ erwachsene Zebrafische in Sex getrennten Paarungtanks. Am nächsten Morgen bereiten Sie die DNA-Lösung nach Manuskriptanweisungen vor und injizieren Sie innerhalb von 45 Minuten nach der Befruchtung etwa 4,2 Nanoliter dieser Lösung in eine Zelle Zebrafisch-Embryonen.
Halten Sie die injizierten Embryonen in E drei Medium und einem 28 Grad Celsius Inkubator für 24 Stunden, dann rufen Sie die toten und deformierten Embryonen aus der Gruppe. Übertragen Sie bis zu 20 gesunde Embryonen in ein 50-Milliliter-Rohr, füllen Sie es mit 10 Milliliter E drei und legen Sie eine Kappe auf jede Röhre. Legen Sie ein Rack mit den 50 Milliliter Röhren aufrecht in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 80 bis 90 Minuten, um sicherzustellen, dass der Wasserstand im Bad höher ist als die E drei in der Röhre.
Entfernen Sie das Rohrgestell aus dem Wasserbad und legen Sie es in den 28 Grad Celsius Inkubator. Bis zu einer Stunde für die E drei abkühlen lassen und die Embryonen auf die Temperatur reakklimatisieren. Dann übertragen Sie sie auf Petri-Gerichte mit 0,2 Millimolar PTU und E drei warm gehalten in der 28 Grad Celsius Inkubator.
Zwei bis vier Stunden nach dem Hitzeschock untersuchen Sie die Embryonen unter einem Standard-Fluoreszenz-Sezierenmikroskop auf expression von GFP oder YFP, das auf eine erfolgreiche Brainbow-Rekombination hinweist. Wählen Sie Embryonen mit einem robusten FP-Ausdruck durch und übertragen Sie sie auf eine separate Schale mit PTU. Stellen Sie sich ein, zwei oder drei Tage nach der Befruchtung vor.
Expression, die unter einem Fluoreszenzmikroskop verdsimiert erscheint, kann in der konfokalen Zeitraffer-Bildgebung tatsächlich gut visualisiert werden. Bereiten Sie vor dem Tag des Experiments die Bildgebungskammer und das Werkzeug zur Embryonenmanipulation vor. Um die Bildkammer vorzubereiten, überlagern Sie vorsichtig einen Kunststoffring in die Mitte einer 60-Millimeter-Petrischale.
Konstruieren Sie den Manipulator, indem Sie eine kleine Länge Nylon-Angelschnur super an das Ende eines vier Zoll großen Holztupferstabs kleben. Falls erforderlich, dechorieren Sie die Embryonen unter einem Seziermikroskop vor der Montage. Um die Embryonen zu montieren, übertragen Sie die Fische in die Mitte des Kunststoffrings in der Bildkammer und entfernen Sie so viel überschüssiges E drei wie möglich mit einer fein gekippten Transferpipette.
Verwenden Sie eine saubere Transferpipette, um den Fisch mit einem Prozent niedriger Schmelze-Agarose und E drei zu bedecken und den gesamten Kunststoffring mit einer Agaroseschicht zu füllen. Ziehen Sie den Embryo dann vorsichtig in die Pipettespitze und zurück in die Agarose, ohne Luftblasen einzuschleusen. Verwenden Sie einen Embryo-Manipulator, um den Fisch und die Agarose schnell zu orientieren, bevor sie verhärtet.
Wenn Sie die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop machen, positionieren Sie den Embryo so nah wie möglich an der oberen Oberfläche der Agarose, um sicherzustellen, dass sie parallel zur Unterseite der Bildkammer mit ihrem Geraden Schwanz sind. Warten Sie, bis die Agarose aushärtet, füllen Sie dann die Bildgebungskammer mit E drei, so viel wie möglich hinzugefügt, um die Verdunstung im Laufe der Bildgebung zu berücksichtigen. Legen Sie die Bildkammer mit dem Fisch und E drei auf das konfokale Mikroskop.
Wählen Sie dann das Objektiv mit einer hohen numerischen Blende und einem langen Arbeitsabstand aus. Suchen Sie einen Bereich mit entsprechend dichter und heller Beschriftung von Zellen, und richten Sie die Erfassungsparameter ein. Dies ist ein Beispiel für die Verwendung von Zen-Software, aber die Einstellungen variieren je nach verfügbaren Mikroskop- und Laserlinien.
Bereiten Sie drei Spuren vor, um jeden FP-Kanal sequenziell abzubilden. Verwenden Sie einen Argonlaser, um CFP mit 458 Nanometern und YFP mit 514 Nanometern zu begeistern, und verwenden Sie einen DPSS 561 Nanometer Laser, um dTomato zu begeistern. Sammeln Sie die Missionen für die drei auf den entsprechenden Wellenlängen.
Wählen Sie den zu abbildenden Z-Stack-Bereich und ein Zeitintervall zwischen 10 und 30 Minuten aus, um mitotische und apoptotische Ereignisse nachzuverfolgen. Wählen Sie schließlich die Länge der Imaging-Sitzung aus, und führen Sie das Experiment aus. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, speichern Sie die Rohdaten im CZI-Format, wenn Sie Zen oder ein anderes Format verwenden, das mit Fidschi kompatibel ist, und importieren Sie die Bilder dann mit dem Importvon Bioformaten nach Fidschi.
In vivo multicolor Zeitraffer-Bildgebung wurde verwendet, um Brainbow farbcodierte Klone von Zellen in der proliferativen ventrikulären Zone des sich entwickelnden Zebrafisch-Hinterhirns zu zeigen. Brainbow beschriftete Zellen, die entlang einer bestimmten radialen Faser angeordnet sind, teilten sich die gleiche Farbe. Das kann als relative RGB-Kanalgewichtungen quantifiziert werden.
Dies deutet darauf hin, dass diese Funkgruppen Klone von teilenden Zellen waren und dass ihre ähnliche Farbe verwendet werden könnte, um sie als klonal verwandt zu identifizieren. Eine quantitative Farbanalyse zeigte, dass Tochterzellen die gleiche Farbe wie die Zelle ihrer Mutter ausdrücken. Aber dass benachbarte Funkcluster von Zellen voneinander unterschieden werden können.
Zahlreiche Klone verwandter Zellen können gleichzeitig über Stunden in vivo verfolgt werden, was eine Multiplex-Linienanalyse und einen Vergleich ermöglicht. Die Quantifizierung des Farbausdrucks in Klonen bei zwei und dann wieder an drei Tagen nach der Befruchtung zeigte, dass der Brainbow-Ausdruck von zwei bis drei Tagen relativ konstant blieb. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigte zahlreiche Zellen, die sich einer interkinetischen Kernmigration und Zellteilung von einem bis zwei Tagen nach der Befruchtung unterziehen, was es ermöglicht, den Zellzyklus zu untersuchen.
Es wurde ein durchschnittlicher Zellzyklus von 8,4 Stunden berechnet, der mit früheren Messungen bei Zebrafischen vergleichbar ist. Darüber hinaus wurde diese bildgebende Technik verwendet, um einzelne Zellen zu beobachten, die den stereotypen morphologischen Veränderungen im Zusammenhang mit Apoptose unterzogen wurden, wie Zwierblessur und Zellfragmentierung. Da diese Methode in vivo durchgeführt wird, können Zebrafische aus der Bildkammer gerettet und zu späteren Zeitpunkten für Bildgebung oder andere Experimente aufrechterhalten werden.
Der Einsatz dieser Technik ermöglicht es uns, neue Fragen über die Rollen klonal verwandter Zellen während der neuronalen Entwicklung zu erforschen.
