Diese Methode versucht, drei häufig verwendete Methoden zur Bewertung der Migration von normalen Neutrophilen in vivo und in vitro sowie die Infiltration pathologischer Neutrophile im Maus-Arthritis-Modell zu beschreiben. Wir denken, dass diese Methode für andere Forscher auf diesem Gebiet nützlich sein könnte. Dieses Protokoll enthält die methodischen Details zur Bewertung der Migrationskapazität von Neutrophilen an den Entzündungsstellen mit Hilfe von Luftbeutel-Assay und adjuvant-induzierter Arthritis.
Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Arthritistherapie, indem die Modellgruppe mit der Behandlungsgruppe verglichen wird. Diese Methode könnte Einblick in entzündliche Erkrankungen geben und kann auf entzündliche Darmerkrankungen angewendet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Qingyi Lu und Haixu Jiang, Postgraduierten aus unserem Labor.
Nach der Anästhesisierung der Mäuse am Tag Null verwenden Sie einen 0,22-Mikron-Filter, der an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, um ein Volumen von drei Millilitern sterilisierter Luft zu erhalten. Heben Sie die Rückenhaut der anästhesierten Maus mit einer Pinzette an und verwenden Sie subkutan eine 26-Spur mit einer 3/8-Zoll-Nadel, um drei Milliliter der sterilisierten Luft zu injizieren. Entfernen Sie die Mäuse nach der Behandlung von der Atemeinheit und legen Sie sie in einen gut eingestellten Käfig.
Überwachen Sie die Mäuse, um sicherzustellen, dass sie am Leben sind, bis sie anfangen, sich zu bewegen. Am dritten Tag spritzen Sie weitere drei Milliliter sterilisierte Luft in die zuvor etablierte Lufttasche, um den Luftbeutel zu erhalten. Am sechsten Tag verschiedene Behandlungen in den Luftbeutel injizieren.
Injizieren Sie einen Milliliter PBS als Negativkontrolle und injizieren Sie ein Milliliter eines Mikrogramms pro Milliliter LPS als positive Kontrolle, um lokale Entzündungen zu induzieren. Nach sechs Stunden, opfern Sie die Mäuse. Injizieren Sie für jeden Luftbeutel einen Milliliter Waschpuffer, um den Luftbeutel zu waschen und das entzündliche Exudate in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu sammeln.
Dann waschen Sie den Luftbeutel mit zwei Milliliter Waschpuffer zweimal und sammeln Sie das entzündliche Exudate im selben Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 100 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer wieder aus.
Zählen Sie die Zellen, um das Neutrophilenverhältnis mit dem automatischen Hämatologieanalysator zu quantifizieren. Setzen Sie Freunds Adjuvans durch Wirbeln von mindestens fünf Sekunden aus und ziehen Sie dann 100 Mikroliter Suspension in einen Insulininjektor. Nach der Anästhesisierung die gewählte Pfote markieren und 20 Mikroliter komplettes Freund-Adjuvans aus dem Injektor in vier periartikuläre Flecken auf dem Sprunggelenksraum injizieren.
Legen Sie die verarbeiteten Mäuse in die neue Kammer. Überwachen Sie die Mäuse, um sicherzustellen, dass sie atmen, bis sie wieder die Fähigkeit, sich zu bewegen. Verwenden Sie alle drei Tage ein Taschendickenmessgerät, um den Durchmesser des Sprunggelenks zu messen.
Bewerten Sie auch die Schwere der Arthritis anhand des Bewertungskriteriums für Arthritis. Null ist normal. Keine Hinweise auf Erythem und Schwellung.
Eine davon ist die mildeste Arthritis. Erythem und leichte Schwellung enden auf die Tarsals oder das Sprunggelenk. Zwei ist die moderate Arthritis.
Erythem und leichte Schwellungen, die sich vom Knöchel bis zu den Tarsals erstrecken. Drei ist die schwere Arthritis. Erythem und moderate Schwellung, die sich vom Knöchel bis zu den Metatarsalgelenken erstreckt.
Vier ist die schwerste Arthritis. Erythem und starke Schwellungen umfassen den Knöchel, Fuß und Ziffern, oder Ankylose der Gliedmaße. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, entfernen Sie die Haut und einen Teil des Muskels mit einer Pinzette und einer Schere aus dem Hinterbein.
Sprühen Sie das Gelenk mit 70% Ethanol und entfernen Sie den Rest der Muskeln mit einem Papiertuch. Fixieren Sie das Sprunggelenk in 4%Paraformaldehyd für zwei Tage bei Raumtemperatur. Dann entkalken Sie das Gelenk in 10%EDTA für einen Monat bei Raumtemperatur und ändern Sie das Medium wöchentlich.
Legen Sie das Gewebe nach einem Monat in eine markierte Form mit einem bestimmten Volumen an flüssigem Paraffin bei etwa 60 Grad Celsius, um das Gewebe einzubetten. Kurz abkühlen. Stellen Sie die Dicke des Mikrotomes auf vier Mikrometer ein und schneiden Sie Scheiben.
Dann schweben die Abschnitte in einem 43 Grad Celsius Wasserbad für eine kurze Zeit, um die Abschnitte zu erweitern. Montieren Sie die Abschnitte auf Rutschen und legen Sie die Rutschen in den Ofen bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden. Für die zukünftige Verwendung, konservieren Sie die Rutschen bei minus 20 Grad Celsius.
Als nächstes legen Sie die Dias in ein Regal und führen Sie Waschungen in Xylol und Ethanol nach dem Manuskript durch, um bei Raumtemperatur zu rehydrieren. Schließlich drei Minuten lang in fließendem Leitungswasser waschen. Dann färben Sie in 0.1%schnelle grüne Lösung für fünf Minuten.
10 Sekunden lang 1%Essigsäure abspülen und in 0,1%Safranin O Färbelösung 20 Minuten färben. Danach tauchen Sie die Dias in die Xylol- und Ethanol-Waschlösungen nach dem Manuskript ein. Montieren Sie die Gewebeabschnitte auf die Objektstufe und beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.
Um Neutrophile zu visualisieren, führen Sie immunhistochemische Färbung durch, indem Sie zuerst die Paraffinabschnitte für zwei Stunden bei 78 Grad Celsius backen. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die Xylol-, Ethanol-, Wasser- und PBS-Waschungen entsprechend dem Manuskript durch, um bei Raumtemperatur zu rehydrieren. Fügen Sie dann einen Tropfen Permeabilisierungspuffer hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
Inkubieren Sie die Abschnitte in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach spülen Sie die Dias in PBS dreimal dreimal für drei Minuten. Vermeiden Sie das direkte Spülen des Gewebes.
Als nächstes führen Sie wärmeinduzierte Antigen-Epitop-Retrieval. Ordnen Sie die Dias in einem Rack an. Tauchen Sie die Dias in den mit Abrufpuffer gefüllten Druckkessel ein.
Setzen Sie den Druckkessel in den Mikrowellenherd und stellen Sie den Mikrowellenherd auf 600 Watt und erhitzen Sie die Dias für 10 Minuten. Nach dem Kochen die Rutschen im Kessel auf 90 Grad Celsius abkühlen lassen. Nehmen Sie die Dias heraus und spülen Sie sie dreimal dreimal in PBS.
Um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen, tauchen Sie die Dias 15 Minuten lang in frisch zubereitetes 3%Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur ein. Spülen Sie Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Umreißen Sie einen großen Kreis um die Probe mit einem hydrophoben Stift.
Vermeiden Sie es, die Probe zu berühren. Fügen Sie auf die Probe 50 bis 100 Mikroliter 3%Rinder-Serumalbumin zu blockieren und legen Sie die Proben in einer feuchtigkeitskontrollierten Kammer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Entfernen Sie dann die Blockierungslösung.
Fügen Sie schnell 50 Mikroliter PBS verdünnten Primärantikörper zu jedem Abschnitt hinzu. Inkubieren Sie die Dias in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei vier Grad Celsius über Nacht. Nehmen Sie am zweiten Tag das Tablett heraus und lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
Dann spülen Sie die Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Fügen Sie 50 Mikroliter PBS verdünnte Sekundärantikörper in das Gewebe. Inkubieren Sie diagleitet in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Dann spülen Sie die Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Entwickeln Sie in verdünnter DAB-Lösung für fünf Minuten. Vermeiden Sie die Entwicklung einer dunklen Farbe, die durch Überreaktion des DAB verursacht wird.
Spülen Sie die Dias in destilliertem Wasser. Die Dias in Hämatoxylin 10 Sekunden lang gegenbedecken und fünf Minuten lang im Leitungswasser spülen. In säurehaltigen Superschnellen Differenzierungslösung für drei Sekunden abspülen, dann in Leitungswasser für 10 Minuten abspülen.
Tauchen Sie die Dias in die Ethanol- und Xylolwaschungen bei Raumtemperatur gemäß dem Manuskript ein. Befestigen Sie den Coverslip mit Montagelösung. Beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.
In dieser Studie wurden Luftbeutelexperimente durchgeführt, um die durch LPS in vivo stimulierte Neutrophilenrekrutierung zu untersuchen. Die Leukozyten-Teilmengen in den Luftbeutel-Exsudaten waren viel höher als bei der Kontrolle. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die adjuvantinduzierte Arthritisgruppe signifikante Ödeme in der Pfote.
Der Sprunggelenksdurchmesser wurde erhöht und die Arthritis-Score stieg konstant. Knorpelschäden sind das repräsentative Syndrom der rheumatoiden Arthritis. Die CFA-Herausforderung führte zu einer großen Menge an Leukozyteninfiltration, signifikanter Knorpelerosion und Synovialhyperplasie.
MPO in allen Expressionsebenen sind repräsentative Marker der neutrophilen Infiltration, die im Gelenkabschnitt deutlich hochreguliert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Luft in die Haut injiziert wird, aber nicht in den Muskel. Wir können auch die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen durch immunhistochemische Färbung der Knöchelgelenkgewebeabschnitte mit Anti-p84 untersuchen oder Diese Methoden können verwendet werden, um andere entzündliche Erkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen zu untersuchen.
